基于微型CRISPRCas蛋白Cas12f1的碱基编辑器系统及其应用

本发明属于基因治疗的平台技术，特别是涉及一种基于微型crispr cas蛋白cas12f1的碱基编辑器系统及其应用，可以通过腺相关病毒(adeno-associated virus，aav)，lnp等手段递送至体内，用于定点突变基因组dna中的单个碱基以进行单碱基突变遗传疾病的基因治疗。

背景技术：

1、人类的疾病大多与基因密切相关，所以根据基因进行针对性的改变一直是生命科学的长期愿望。据统计，在人类遗传疾病中有超过32000种基因突变是由单碱基突变引起的[1]。因此，开发一种精确、高效并且安全的基因编辑工具来修复这些单碱基突变，对于基础研究和遗传疾病的基因治疗有着极为重要的意义。

2、在2016～2017年，哈佛大学的david r.liu实验室首次开发了两种不同的单碱基编辑器：胞嘧啶碱基编辑器(cytosine base editor，cbe)和腺嘌呤碱基编辑器(adeninebase editor，abe)[2-3]。基于cbe和abe，能够在基因组dna中实现4种碱基之间的转换(cto t，ato g，t to c，and g to a)，为相当大一部分的单碱基遗传疾病基因治疗的实现提供了极大的可能性。

3、不过，大多数单碱基遗传疾病需要在体内进行治疗，这就需要一种有效的递送载体，将单碱基编辑工具递送至体内。腺相关病毒(adeno-associated virus，aav)是美国食品和药物管理局(fda)批准的一种相对安全，且能进行大规模生产的载体。但是，aav载荷有限，仅能包装<4.7kb的基因[4]。目前，大部分的碱基编辑器是基于crispr-cas9系统的，spcas9蛋白>4.1kb，在此基础上所开发的碱基编辑器将近6.2kb，远远超出了这一限制，阻碍了大多数碱基编辑器的临床应用。因此，迫切需要开发一个更紧凑、高效的微型cas系统来进行基因治疗的临床应用。

4、un1cas12f1是ii类v-f型crispr-cas蛋白，只有529个氨基酸，大小远远小于cas9蛋白，更适合通过aav递送至体内[5]。两个cas12f分子以二聚体的形式与一个sgrna分子组装在一起，形成cas12f1-sgrna复合体[6]。通过sgrna识别tttr pam序列，结合到靶基因位点，切割单链或双链dna[7]。2021年，韩国生命科学技术研究院的kim实验室通过改造un1cas12f1的guide rna，使该系统转化为高效且特异的基因组编辑工具，并证实了un1cas12f1通过aav递送的可行性[8]。同年，斯坦福大学的亓磊实验室对un1cas12f1蛋白进行了迭代饱和突变，将改造后的系统命名为casmini，并证实了un1cas12f1可以在哺乳动物细胞中实现碱基编辑和基因编辑[9]。

5、基于un1cas12f1的胞嘧啶碱基编辑器理论上只有3.7kb大小，小于aav包装容量所限制的4.7kb，因此有望开发以un1cas12f1为基础的碱基编辑器用于遗传疾病的基因治疗。虽然un1cas12f1已被证实可以在哺乳动物细胞中实现碱基编辑，但是目前的编辑效率极低，不到10％，这显然不足以应用于基因治疗。

6、因此，现有技术中亟需提高un1cas12f1碱基编辑器的编辑效率，以实现通过aav递送进行遗传疾病基因治疗。

技术实现思路

1、鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种基于微型crispr cas蛋白dun1cas12f1(d326a&d510a)的碱基编辑器系统及其应用，用于解决现有技术中casmini编辑器编辑效率不高的问题。

2、为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种完整的主题名称一种基于微型crispr cas蛋白dun1cas12f1(d326a&d510a)的碱基编辑器系统，其特征在于，所述碱基编辑器系统至少包括：dun1cas12f1(d326a&d510a)蛋白的突变子或编码其的核酸；所述dun1cas12f1(d326a&d510a)蛋白的突变子具有d143r/t147r/t203r/e206r中一种或多种突变；所述dun1cas12f1(d326a&d510a)蛋白其氨基酸序列如seq id no.1所示。

3、具体是通过突变改造dun1cas12f1(d326a&d510a)蛋白，并融合双链dna结合蛋白或染色质重塑多肽来增强其结合dna的能力，极大地提升了碱基编辑的效率。进而，发明人也对dun1cas12f1(d326a&d510a)的guide rna进行了改造，将其尺寸缩小到了原始尺寸的一半的同时，能维持较高的编辑效率。

4、作为本发明的某些实施方式，所述dun1cas12f1(d326a&d510a)蛋白的突变子具有d143r/t147r/e206r、d143r/t203r/e206r、或t147r/t203r/e206r三重突变。

5、作为本发明的某些实施方式，所述dun1cas12f1(d326a&d510a)蛋白的突变子具有d143r/t147r/t203r/e206r四重突变。

6、作为本发明的某些实施方式，所述碱基编辑器系统还包括sgrna的突变子或编码其的核酸。

7、作为本发明的某些实施方式，所述sgrna的突变子在3’端具有20个碱基长度的spacer；

8、作为本发明的某些实施方式，优选地，所述sgrna的突变子具有如下突变中的一种或多种，sgrna的突变d1，所述sgrna的突变d1为所述sgrna的核酸序列第136位到第148位的核苷酸删除；

9、sgrna的突变d2，所述sgrna的突变d2为所述sgrna的核酸序列第1位到第24位的核苷酸删除；

10、sgrna的突变d3，所述sgrna的突变d3为所述sgrna的核酸序列第36位到第62位的核苷酸删除；

11、sgrna的突变d4，所述sgrna的突变d4为所述sgrna的核酸序列第29位到第70位的核苷酸删除；

12、所述sgrna的核酸序列如seq id no.2所示。

13、作为本发明的某些实施方式，所述sgrna的突变子具有如下突变中的一种：

14、sgrna的突变v1，为所述sgrna的突变d1基础上还有所述突变d2；

15、sgrna的突变v2，为所述sgrna的突变d1基础上还有所述突变d3；

16、sgrna的突变v3，为所述sgrna的突变d1基础上还有所述突变d4；

17、sgrna的突变v4，为所述sgrna的突变d2基础上还有所述突变d3；

18、sgrna的突变v5，为所述sgrna的突变d2基础上还有所述突变d4；

19、sgrna的突变v6，为所述sgrna的突变d1基础上还有所述突变d2和所述突变d3；

20、sgrna的突变v7，为所述sgrna的突变d1基础上还有所述突变d2和所述突变d4。作为本发明的某些实施方式，所述sgrna的突变子为sgrna的突变子v6。

21、作为本发明的某些实施方式，所述dun1cas12f1(d326a&d510a)蛋白的突变子或编码其的核酸在dun1cas12f1(d326a&d510a)蛋白的突变子的n端还含有sso7d。

22、作为本发明的某些实施方式，所述dun1cas12f1(d326a&d510a)蛋白的突变子和所述sso7d融合表达。

23、作为本发明的某些实施方式，所述sso7d其氨基酸序列如seq id no.5所示。作为本发明的某些实施方式，所述dun1cas12f1(d326a&d510a)蛋白的突变子或编码其的核酸在dun1cas12f1(d326a&d510a)蛋白的突变子其n段端还含有脱氨基酶的基因序列；所述脱氨基酶包括腺嘌呤脱氨酶、胞嘧啶脱氨酶。

24、作为本发明的某些实施方式，所述腺嘌呤脱氨酶包括可用于abe编辑系统的腺嘌呤脱氨酶。

25、作为本发明的某些实施方式，所述腺嘌呤脱氨酶包括ectada及其进化体。

26、作为本发明的某些实施方式，所述腺嘌呤脱氨酶包括tada7.10、或tada8e。

27、作为本发明的某些实施方式，所述腺嘌呤脱氨酶为腺嘌呤脱氨酶tada和tada8e二聚体。

28、作为本发明的某些实施方式，所述腺嘌呤脱氨酶与所述dun1cas12f1(d326a&d510a)蛋白的突变子融合表达。

29、作为本发明的某些实施方式，所述腺嘌呤脱氨酶tada其氨基酸序列如seq idno.3所示，所述腺嘌呤脱氨酶tada8e其氨基酸序列如seq id no.4所示。

30、作为本发明的某些实施方式，所述腺嘌呤脱氨酶的基因序列5’段还包括sso7d的基因序列。

31、作为本发明的某些实施方式，所述腺嘌呤脱氨酶和所述sso7d融合表达。

32、作为本发明的某些实施方式，所述sso7d其氨基酸序列如seq id no.5所示。

33、作为本发明的某些实施方式，所述dun1cas12f1(d326a&d510a)蛋白的突变子、所述腺嘌呤脱氨酶和所述sso7d融合表达，从n端开始次序依次为所述sso7d蛋白、所述腺嘌呤脱氨酶tada、所述腺嘌呤脱氨酶tada8e、所述dun1cas12f1(d326a&d510a)蛋白的突变子。

34、作为本发明的某些实施方式，所述dun1cas12f1(d326a&d510a)蛋白的突变子或编码其的核酸在dun1cas12f1(d326a&d510a)蛋白的突变子其n段端还含有胞嘧啶脱氨酶。

35、作为本发明的某些实施方式，所述胞嘧啶脱氨酶包括可用于cbe编辑系统的胞嘧啶脱氨酶，所述可用于cbe编辑系统的胞嘧啶脱氨酶包括apobec1家族、apobec3家族、aid家族脱氨酶、cda家族以及进化后的ectada突变体。

36、作为本发明的某些实施方式，所述dun1cas12f1(d326a&d510a)突变子的编码其的核酸为质粒、腺病毒、或慢病毒；所述sgrna突变子的编码其的核酸为质粒、腺病毒、或慢病毒。

37、优选地，所述质粒为pcmv。

38、为了上述目的以及其他目的，本发明还提供了一种重组载体，所述重组载体包含有所述的dun1cas12f1(d326a&d510a)蛋白突变子的编码核酸、和/或所述sgrna突变子的编码核酸。

39、本发明还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含所述的碱基编辑器系统，所述宿主细胞为哺乳动物细胞、昆虫细胞、大肠杆菌、酵母细胞。

40、作为本发明的某些实施方式，所述宿主细胞为是hek293ft细胞。

41、作为本发明的某些实施方式，所述宿主细胞包括人原代细胞。

42、作为本发明的某些实施方式，所述人原代细胞包括人诱导多能干细胞、人原代t细胞或人造血干细胞中的任意一种。

43、作为本发明的某些实施方式，所述宿主细胞包括人免疫细胞。

44、作为本发明的某些实施方式，所述人免疫细胞包括人t淋巴细胞、b淋巴细胞、自然杀伤细胞(nk)、细胞因子诱导的杀伤细胞(cik)、树突状细胞(dc)、巨噬细胞中的任意一种。

45、作为本发明的某些实施方式，所述宿主细胞包括人血液病细胞。

46、作为本发明的某些实施方式，所述人血液病细胞包括人白血病细胞、人白血病肿瘤细胞、人单核细胞白血病细胞、人急性t细胞白血病细胞、人急性髓系细胞白血病、人急性粒细胞白血病、人急性淋巴母细胞白血病细胞中的任意一种。

47、作为本发明的某些实施方式，所述宿主细胞包括肿瘤细胞。

48、作为本发明的某些实施方式，所述肿瘤细胞包括人肺癌细胞、人卵巢癌细胞、人黑色素肉瘤细胞、人肝癌细胞、人结肠癌细胞、人结直肠癌细胞、人宫颈癌细胞、人胃癌细胞、人乳腺癌细胞、人淋巴瘤细胞、人前列腺癌、人食道癌细胞、人甲状腺癌细胞、人胰腺癌细胞、人神经胶质瘤细胞中的任意一种。

49、本发明还提供了所述的碱基编辑器系统、所述的重组载体、所述的宿主细胞在碱基编辑中的应用。

50、本发明还提供了所述的碱基编辑器系统、所述的重组载体、所述的宿主细胞在制备基因编辑的细胞和/或药物中的应用。

51、本发明还提供了所述的碱基编辑器系统、所述的重组载体、所述的宿主细胞在定向进化中的应用。

52、本发明还提供了所述的dun1cas12f1(d326a&d510a)蛋白的突变子。

53、本发明还提供了所述的sgrna突变子。

54、如上所述，本发明的基于微型crispr cas蛋白dun1cas12f1(d326a&d510a)的碱基编辑器系统及其应用，具有以下有益效果：

55、un1cas12f1虽已被证实可在哺乳动物细胞中实现碱基编辑，但目前效率不到10％。本发明通过突变筛选，改造un1cas12f1蛋白，以此来增强蛋白与靶向dna的结合能力，将碱基编辑效率提升到30％。在此基础上，融合了双链dna结合蛋白sso7d，将编辑效率进一步提高到了60％左右。此外，本发明将un1cas12f1 sgrna尺寸截短了一半，并能维持60％左右的编辑效率。