一种DNA亚硫酸盐转化试剂、方法与应用与流程

本发明涉及分子生物学，尤其是涉及一种dna亚硫酸盐转化试剂、方法与应用。

背景技术：

1、表观遗传学是研究在基因核苷酸序列不发生改变的情况下，基因表达水平变化的一门新型遗传学分支学科。表观遗传现象很多，如dna甲基化、组蛋白修饰、rna介导的基因沉默、染色体失活等。其中，dna的甲基化是高等真核生物中最主要的表观遗传学机制。

2、所谓dna甲基化是指在dna甲基化转移酶的作用下，基因组5'-cpg-3'二核苷酸的胞嘧啶5'碳位共价键结合一个甲基基团，为5-甲基胞嘧啶(5-mc)，其含量占所有胞嘧啶残基的2-5％。dna甲基化与人类发育、基因转录调节、遗传印记和肿瘤疾病的密切关系。特别是cpg岛异常甲基化与肿瘤抑制基因的转录失活有关，基因组中富含cpg的一段dna称为cpg岛，cpg常成簇存在，长度在1～2kb左右。迄今为止，超过1000多个基因cpg高甲基化与癌症有关。癌细胞中特定基因的甲基化为癌症诊断提供一种早期标志物，异常基因dna甲基化主要见于启动子或第一外显子中的5'-cpg-3'二核苷酸。

3、由于5-甲基胞嘧啶与胞嘧啶具有相同的碱基配对行为，因此不能简单通过基因测序来确定。在20世纪90年代早期之前，很少有技术方法能够在单个cpg位点水平上评估基因组dna中的甲基化模式，并且大多数技术需要相对大量的起始dna(高达10μg)。1992年，frommer首先报道dna亚硫酸盐修饰确定dna分子中胞嘧啶残基的甲基化状态的方法，并提高了转化dna的产量和分析效率。亚硫酸盐在单链dna中将胞嘧啶转化为尿嘧啶，而5-甲基胞嘧啶(5-mc)则不被转化，用于确定dna分子中胞嘧啶残基的甲基化状态。dna经亚硫酸盐转化处理后，可采用核酸测序、定量pcr和基因芯片等分析来确定碱基甲基化。

4、重亚硫酸盐转化法是公认的dna甲基化分析的标准手段，重亚硫酸盐处理后，未甲基化的胞嘧啶脱氨成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶则不发生变化，经过pcr(聚合酶链式反应)扩增，尿嘧啶(u)转换为胸腺嘧啶(t)，而甲基化的5-甲基胞嘧啶(5mc)重新恢复成胞嘧啶(c)。由于在甲基化dna和异常甲基化dna混杂的样品中，甲基化异常dna占少数，因此在下游分析时需要大量的克隆和测序，耗时耗力，且所用链特异性pcr不是特异扩增变异靶序列，扩增效率低，且检测灵敏度低。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种dna亚硫酸盐转化试剂、方法与应用。

2、本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

3、本发明的第一个目的是提供一种dna亚硫酸盐转化试剂，所述转化试剂由nahso3和na2so3组成；

4、nahso3和na2so3的摩尔比为2-10：1。

5、本发明的第二个目的是提供一种dna亚硫酸盐转化的组合物，所述组合物由dna保护剂、溶剂和亚硫酸盐转化试剂组成，所述转化试剂由nahso3和na2so3组成；所述dna保护剂为氢醌或奎诺二甲基丙烯酸酯；所述溶剂为水。

6、在本发明的一个实施方式中，所述dna保护剂为氢醌。

7、在本发明的一个实施方式中，所述dna保护剂和亚硫酸盐转化试剂的体积比为1：3-10；

8、nahso3和na2so3的摩尔比为2-10：1。

9、在本发明的一个实施方式中，所述dna保护剂和亚硫酸盐转化试剂的体积比为1：3-6；进一步的，所述dna保护剂和亚硫酸盐转化试剂的体积比为1：5；

10、nahso3和na2so3的摩尔比为2-5：1；进一步的，nahso3和na2so3的摩尔比为3：1。

11、本发明的第三个目的是提供一种dna转化试剂盒，包括上述dna亚硫酸盐转化的组合物。

12、在本发明的一个实施方式中，试剂盒还包含溶剂、结合液、洗涤液、洗脱液或纯化磁珠中的一种或多种。

13、在本发明的一个实施方式中，所述溶剂为水，所述结合液是含异硫酸氰胍的tris溶液，所述洗涤液是tris的醇溶液，所述洗脱剂是te缓冲液，所述磁珠是羟基磁珠。

14、本发明的第四个目的是提供一种dna亚硫酸盐处理方法，包括以下步骤：

15、将dna与上述组合物接触，得到反应体系，然后进行孵育，后处理得到亚硫酸盐转化后的dna-dna中未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶；

16、其中，所述dna为变性处理后的单链dna，

17、反应体系中，dna保护剂的浓度为0-100mm，nahso3的浓度为1-6m，na2so3的浓度为0.5-3m；反应体系的ph为5-6。

18、在本发明的一个实施方式中，反应体系中，dna保护剂的浓度为10-30mm，进一步的，dna保护剂的浓度为20mm；

19、nahso3的浓度为4m，na2so3的浓度为1m；

20、反应体系的ph为5.1-5.5。

21、在本发明的一个实施方式中，dna经高温变性处理(单链dna)后，与组合物接触。

22、在本发明的一个实施方式中，所述孵育包括一次孵育和二次孵育；

23、其中，一次孵育过程中，温度为90-99℃，时间为5-20分钟；

24、二次孵育过程中，温度为50-80℃，时间为15-60分钟。

25、在本发明的一个实施方式中，一次孵育过程中，温度为94-99℃，时间为5-15分钟；

26、二次孵育过程中，温度为50-70℃，时间为30-60分钟。

27、在本发明的一个实施方式中，所述后处理包括以下步骤：

28、(1)将亚硫酸盐转化后的dna与磁珠和结合液接触，混匀后静置，得到结合有dna的磁珠，

29、(2)使用洗涤液洗涤步骤(1)得到的结合有dna的磁珠，得到预处理磁珠；

30、(3)使用洗脱液将dna从步骤(2)得到的预处理磁珠上洗脱，得到亚硫酸盐转化后的dna。

31、在本发明的一个实施方式中，所述结合液为异硫氰酸胍。

32、本发明的第五个目的是提供一种通过上述方法在检测dna甲基化中的应用，具体包括以下步骤：

33、对转化的dna进行序列检测与未转化dna的序列比较，获得dna的甲基化结果。

34、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

35、(1)简单：dna无需转换前naoh预处理；

36、(2)快速：独特的亚硫酸盐配方，dna转化流程可在1h完成；

37、(3)转化率高：将非甲基化胞嘧啶完全转化为尿嘧啶达99％以上；

38、(4)灵敏度高：dna损失少，含独特的dna保护剂，减少高温高盐引起的dna降解；

39、(5)适用性广：处理后的dna样品适合于下游灵敏的甲基化分析，如甲基化pcr、甲基化测序法及甲基化芯片等；

40、(6)临床适用性广：由于亚硫酸盐转化的敏感性增加，适合分析dna含量少的临床标本如体液尤其是血清或血浆，也可以应用于痰、粪便、尿液或脑脊液中的dna。