西瓜幼苗耐低温叶面积性状的KASP分子标记及用途

本发明属于蔬菜农艺性状分子标记开发和分子标记辅助育种，具体涉及一种适用于西瓜幼苗耐低温叶面积性状快速筛选和分子标记辅助育种的kasp分子标记及用途。

背景技术：

1、低温胁迫是影响植物生长、发育、生产力和分布的主要环境因素。根据温度范围不同，低温胁迫可以分为冷胁迫（chilling stress，0℃及以上）和冻胁迫（freezing stress，0℃以下），其中冷胁迫是热带及亚热带地区植物遭遇的主要胁迫方式。冷胁迫在植物整个生长发育进程中都能造成不利影响，低温会降低种子的发芽势及幼苗出土率，导致植株生长缓慢、苗弱、叶片萎蔫、坐果率低、产量及品质下降等（guo x，2018；王毅，1994；ding y，2019；ruelland e，2009；thomashow mf，1999）。

2、植株的外部形态特征是植株对低温胁迫最直接的表现，能够直观地反映植物的抗冷性。叶面积是指叶片的表面积，它能直接影响植物对光能的吸收和利用。众多研究表明，在低温胁迫下，黄瓜、番茄、辣椒等园艺作物叶片会出现水渍状斑点，发生萎蔫卷曲干枯等现象，导致植物叶面积的减少，最终减少光合作用效率和光合作用总量。因此叶面积的变化能很好得代表植物耐冷性的好坏，且具有好观察、易测量的优点，在生产上具有重要意义。

3、西瓜[citrullus lanatus (thunb.) matsum. & nakai] 是重要的经济作物, 栽培地域广阔, 经济效益显著。我国是世界重要的西瓜生产国和消费国，近年来，我国西瓜产业发展迅速，面积、产量连续多年位居全球第一。2022年我国西瓜的收获面积、产量分别为138.40万hm2、6038.61万t，分别占全球的47.46%、60.41%。随着产业化、专业化步伐的加快，西瓜生产逐步走向区域化和规模化生产格局。从全国区域布局来看，西瓜生产布局主要以华东和中南两大地区为主，两区域合计生产了70%左右的西瓜（余家庆, 2024）。

4、西瓜原产于非洲热带地区，对低温反应敏感。华东地区西瓜早春栽培，其苗期或定植初期常常受到低温侵袭影响了植株生长发育，推迟了果品上市期，造成较大经济损失。生产上通常采取物理措施（多层覆盖、人工加温等）、栽培措施（嫁接、低温炼苗、调节基质物料配比、添加益生菌等）、喷施化学试剂（激素类生长调节剂、渗透调节物质、非酶促抗氧化物质等）来缓解幼苗的受害程度或增强其耐冷性，但同时也增加了生产成本和生物安全隐患，因而培育和推广耐冷强的西瓜新品种是解决这一问题的根本途径。然而，衡量西瓜耐低温性能的表型高效精准评价技术以及育种可用分子标记的缺乏，严重制约了西瓜耐低温分子育种的进展。

5、上文涉及的参考文献如下：

6、余家庆,夏咏.我国西瓜产业现状、问题及建议[j].现代化农业.2024(05):25-27.

7、guo x, liu d, chong k. cold signaling in plants: insights intomechanisms and regulation[j]. integr plant biol. 2018(9):745-756.

8、王毅，杨宏福，李德树 园艺植物冷害和抗冷性的研究—文献综述[j].园艺学报,1994,21(3):239-244.

9、ding, y., shi, y. and yang, s. advances and challenges in uncoveringcold tolerance regulatory mechanisms in plants[j]. new phytol. 2019.222:1690-1704.

10、ruelland e, vaultier mn, zachowski a, hurry v. cold signalling andcold acclimation in plants[j]. advances in botanical research.2009.49: 35–150.

11、thomashow mf. plant cold acclimation: freezing tolerance genes andregulatory mechanisms. annual review of plant physiology and plant molecularbiology. 1999. 50: 571–599.

技术实现思路

1、本发明的目的是针对现有技术不足，提供一种西瓜幼苗耐低温叶面积性状的kasp分子标记及用途，本发明所获得的分子标记lac (relative rate of change in leafarea under chilling stress)为西瓜幼苗耐低温响应控制叶面积相对变化的kasp标记，能用于耐低温和非耐低温西瓜的辅助育种。

2、为了达到上述目的，本发明提供一种西瓜幼苗耐低温叶面积性状的kasp分子标记，位于西瓜基因组11号染色体的16128196bp处，前后50bp的序列如seq id no.1或seq idno.2所示。

3、进一步地，所述kasp分子标记基因型为c或t；c基因型前后50bp的序列如seq idno.1所示，对应的表型为非耐低温型；t基因型前后50bp的序列如seq id no.2所示，对应的表型为耐低温型。

4、本发明还提供一种所述kasp分子标记在鉴定西瓜幼苗低温条件下叶面积大小基因方面的用途。

5、进一步地，分子标记引物选自如下引物对，其中，核苷酸序列为5’-3’：

6、正向引物f-hex如seq id no.3所示：

7、gaaggtcggagtcaacggatttcggcatcttgttgagctcca；

8、正向引物f-fam如seq id no.4所示：

9、gaaggtgaccaagttcatgcttcggcatcttgttgagctccg；

10、反向引物r如seq id no.5所示：

11、cggaagtggtcaagcaaatcaacg。

12、进一步地，所述kasp分子标记在鉴定西瓜幼苗低温条件下叶面积大小基因方面的用途具体包括以下步骤：

13、1）提取待测西瓜品种基因组dna；

14、2）利用所述kasp分子标记对西瓜基因组 dna 进行 pcr 扩增 ；

15、3）根据pcr扩增结果荧光信号的差异，通过kraken 软件，鉴别出每个待测西瓜的基因型：若pcr扩增结果荧光信号颜色与正向引物f-fam的荧光接头颜色一致，则待测西瓜为纯合基因型cc；与正向引物f-hex的荧光接头颜色一致，则待测西瓜为纯合基因型tt；若pcr扩增结果荧光信号颜色与正向引物f-hex、正向引物f-fam的荧光接头颜色均不同，则待测西瓜为杂合基因型ct。

16、进一步地，步骤2）中，所述pcr扩增使用的pcr反应体系为：20~50 ng/μl西瓜基因组dna 5.0 μl，kasp master mix5.0 μl，kasp assay mix 0.14μl ；所述kasp assay mix包含正向引物f-hex、正向引物f-fam和反向引物r，f-hex：f-fam：r的摩尔浓度比为 2：2：5，共10.14μl；pcr程序为：94℃ 预变性，15 分钟；94℃，变性20 秒；61 ℃，-0.6℃/循环，退火60 s，共10个循环；再94 ℃变性20 s，55 ℃退火60 s，29个循环。

17、本发明还提供一种所述kasp分子标记在西瓜低温条件下叶面积大小的分子辅助育种方面的用途。

18、本发明的有益效果如下：

19、1. 前期筛选：可通过苗期提前检测标记基因型，预测后期植株耐低温的叶面积表型。

20、2. 替代表型筛选；利用标记筛选替代大规模低温逆境处理的表型筛选，减少田间工作量以及因逆境处理导致的植株损失。

21、3. 提高筛选效率与准确率：植株耐低温表型是基因型与环境互作后的综合结果，基于表型的耐低温性筛选会因环境差异导致选择误差，结合分子标记对基因型进行筛选可以极大提高筛选的准确性与效率。