特异性结合米酵菌酸的抗体及其应用

本发明涉及特异性结合米酵菌酸的抗体及其应用，属于基因工程。

背景技术：

1、米酵菌酸(bongkrekic acid,ba)是由唐菖蒲伯克霍尔德氏菌产生的剧毒生物毒素。其结构非常稳定，普通烹饪方法难以破坏，且临床上缺乏针对米酵菌酸中毒的有效治疗方案，突发性食物中毒事件常有发生，人体摄入后可引起广泛性器官损害甚至死亡。亟需开发出简单、快速的适用于现场检测的米酵菌酸定量检测方法。

2、识别是检测的基础，目前最为常见的识别元件为抗体。抗体具有高亲和力和特异性等优点，现有技术中，以抗原-抗体检测米酵菌酸主要有以下方案：

3、专利cn113801220b公开了一种米酵菌酸复合抗原、米酵菌酸抗体及其制备方法和酶联免疫试剂盒，其通过对抗原结构优化，通过动物免疫以及杂交瘤细胞制备得到的米酵菌酸抗体灵敏度为10μg/l。

4、专利cn114045266a公开了一种抗米酵菌酸的单克隆抗体及其应用，其同样通过通过动物免疫以及杂交瘤细胞制备，得到了米酵菌酸抗体，在该方案中，将所得抗体以酶联免疫法检测米酵菌酸时，检测限为5.79ng/ml。

5、综上，现有的方案中，均以动物免疫后制备杂交瘤细胞来制备得到米酵菌酸抗体，一方面，这种方法实验步骤繁琐，成本高；另一方面，现有技术提供的抗体在米酵菌酸检测中的检测限仍较高，导致在实际检测中应用场景有限。因此，亟待提供一种制备简单，成本和检测限低的米酵菌酸抗体。

技术实现思路

1、[技术问题]

2、本发明要解决的技术问题是提供一种制备简单，成本和检测限低的米酵菌酸抗体。

3、[技术方案]

4、为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：

5、在第一方面，本发明提供了一种特异性结合米酵菌酸的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原片段包含轻链可变区vl和重链可变区vh，所述vl包含分别具有如seq idno:6、gts、seq id no:7所示氨基酸序列的lcdr1-lcdr3，并且所述vh包含分别具有如seqid no:3、seq id no:4、seq id no:5所示氨基酸序列的hcdr1-hcdr3。

6、在一种实施方式中，所述vl包含seq id no:2所示的氨基酸序列并且所述vh包含seq id no:1所示的氨基酸序列。

7、在一种实施方式中，所述抗体包括重链抗体hc和轻链抗体lc，所述hc具有seq idno.11所示的氨基酸序列，并且所述lc具有seq id no.13所示的氨基酸序列。

8、在一种实施方式中，所述抗原结合片段选自fab、fab’、f(ab’)2、fv或scfv。

9、在第二方面，本发明提供了一种生物材料，所述生物材料包括如下(a)～(c)中的至少一种：

10、(a)：编码第一方面所述的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸；

11、(b)：含有(a)中所述多核苷酸的核酸构建体；

12、(c)：含有(a)中所述多核苷酸或(b)中所述核酸构建体的载体。

13、在第三方面，本发明提供了一种细胞，其含有第二方面所述生物材料。

14、在一种实施方式中，所述细胞以微生物或哺乳动物细胞为宿主。

15、在第四方面，发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒中含有第一方面所述的抗体或其抗原结合片段。

16、在第五方面，发明提供了第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、第二方面所述生物材料或第三方面所述细胞在制备用于检测样本中米酵菌酸的试剂中的应用。

17、在第六方面，发明提供了制备第一方面所述抗体或其抗原结合片段的方法，包括：培养第三方面所述细胞，制备得到第一方面所述抗体或其抗原结合片段。

18、在一种实施方式中，所述方法包括以下步骤：将所述细胞接种于培养基，培养至od600＝0.6～0.8，加入iptg，诱导培养，收集菌体；所述细胞以大肠杆菌为宿主，以质粒pet-22b为表达载体。

19、在一种实施方式中，所述方法包括以下步骤：将所述细胞接种于培养基，于30～40℃，5～10％ co2条件下培养6～7天，收集培养上清；所述细胞以expi293f细胞为宿主，以质粒pcdna3.1为表达载体。

20、在第七方面，发明提供了一种检测样本中是否存在米酵菌酸或其含量的方法，所述方法包括使第一方面所述抗体或其抗原结合片段与样本接触的步骤。

21、与现有技术相比，本发明具备以下有益效果：

22、1.本发明提供的米酵菌酸抗体在用于检测时，检测限显著低于现有技术，且能够实现对米酵菌酸的高灵敏检测。本发明提供的米酵菌酸抗体通过竞争elisa检测方法检测米酵菌酸时的ic50为0.259ng/ml，线性范围为0.5～20ng/ml，检测限为0.410ng/ml。

23、2.本发明通过构建pet-22b-ba质粒，转染e.coli bl21，iptg诱导scfv表达，借助ni亲和柱纯化，从而实现scfv的表达纯化，并将scfv与哺乳动物细胞expi293f表达系统获得的重组全长igg抗体活性进行比较，发现重组全长igg抗体活性高于scfv。

24、3.本发明提供的米酵菌酸抗体制备时不需要动物免疫，制备方法简单。

25、4.本发明中表达的米酵菌酸重组抗体，可根据实验目的进行基因改造，广泛应用于其它靶标的抗体快速制备。

技术特征：

1.一种特异性结合米酵菌酸的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原片段包含轻链可变区vl和重链可变区vh，其特征在于，所述vl包含分别具有如seq id no:6、gts、seqid no:7所示氨基酸序列的lcdr1-lcdr3，并且所述vh包含分别具有如seq id no:3、seq idno:4、seq id no:5所示氨基酸序列的hcdr1-hcdr3。

2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述vl包含seq id no:2所示的氨基酸序列并且所述vh包含seq id no:1所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体包括重链抗体hc和轻链抗体lc，所述hc具有seq id no.11所示的氨基酸序列，并且所述lc具有seq idno.13所示的氨基酸序列。

4.一种生物材料，其特征在于，所述生物材料包括如下(a)～(c)中的至少一种：

5.一种细胞，其特征在于，含有权利要求4所述生物材料。

6.根据权利要求5所述的细胞，其特征在于，所述细胞以微生物或哺乳动物细胞为宿主。

7.试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有权利要求1～3任一所述的抗体或其抗原结合片段。

8.权利要求1～3任一所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求4所述生物材料或权利要求5或6所述细胞在制备用于检测样本中米酵菌酸的试剂中的应用。

9.制备权利要求1～3任一所述抗体或其抗原结合片段的方法，其特征在于，包括：培养权利要求5或6所述细胞，制备得到权利要求1～3任一所述抗体或其抗原结合片段。

10.一种检测样本中是否存在米酵菌酸或其含量的方法，其特征在于，所述方法包括使权利要求1～3任一所述抗体或其抗原结合片段与样本接触的步骤。

技术总结本发明公开了特异性结合米酵菌酸的抗体及其应用，属于基因工程技术领域。本发明提供的米酵菌酸抗体制备方法简单，不需要动物免疫，所得抗体BA‑IgG活性较BA‑scFv好，基于BA‑IgG构建的竞争ELISA标准曲线的IC<subgt;50</subgt;为0.259ng/mL，线性范围为0.5～20ng/mL，检测限为0.410ng/mL，可应用于米酵菌酸免疫分析。技术研发人员：孙秀兰,孙嘉笛,林婉昕,郑梦瑶,马万成,高松,叶永丽,张银志受保护的技术使用者：江南大学技术研发日：技术公布日：2024/9/26