一种检测不同来源胡子鲇性别特异SNP分子标记的引物、方法及应用

本发明属于胡子鲇性别鉴定，具体涉及一种检测不同来源胡子鲇性别特异snp分子标记的引物、方法及应用。

背景技术：

1、胡子鲇(clarias fuscus)，又称塘虱鱼，隶属鲇形目、胡子鲇科、胡子鲇属。该物种肉质细嫩，味道鲜美，经济价值高，是我国南方大面积养殖的淡水鱼类。胡子鲇具有特殊的附属呼吸器官，可适应极低溶氧环境，为广温性鲇科鱼类，具有抗病能力强、养殖简单、周期短、产量高、成本低和容易运输等特点，目前在广西、广东和福建等地形成规模化养殖产业，成为具有较好发展前途的淡水养殖品种。

2、胡子鲇属雄性异配xx/xy性别决定类型，具有明显的性别二态性，在同等养殖条件下，雄鱼生长速度远远高于同龄雌鱼。当养殖胡子鲇达到上市规格时，雌性胡子鲇正处于性腺发育阶段，腹部膨大，其性腺指数远高于雄性，导致雌鱼比同等规格的雄鱼价格低4元/公斤左右。因此，研究和培育全雄胡子鲇品种可以大大节约养殖成本，提高商品鱼质量和经济效益。然而，胡子鲇雌雄个体在胚胎和幼鱼阶段并不表现出形态学差异，从体型大小和生殖器官体表特征也无法进行性别鉴定。通过定位和克隆性别决定候选基因，可以加快实现单性品种繁育的进程。然而，胡子鲇性别决定候选基因尚未报道，这对胡子鲇性腺分化研究和单性苗种培育带来很大的困难，也极大地限制了该物种产业的发展。

3、现有技术存在的问题是：

4、(一)在科研工作中，可以通过解剖等方式对胡子鲇的生理性别进行鉴定，但解剖不仅会导致个体死亡，且效率低下，无法实现大规模鉴定，限制了其在实践生产中的应用；

5、(二)目前的生物技术能够活体鉴别性别，但现有的snp分子标记位于性别决定候选基因的侧翼区域，这类侧翼标记的准确性在不同群体(例如不同家系，不同地理群体)中会有所不同，导致性别鉴定结果的可靠性受到影响，限制了其广泛应用；

6、因此，现有技术存在的主要问题是检测位点并性别并不完全连锁，导致检测的错误率较高，适用性不广泛。最理想的解决方案是将性别决定候选基因开发为性别特异性标记，并进一步验证其准确性。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种检测不同来源胡子鲇性别特异snp分子标记的引物。

2、本发明的目的还在于提供一种不同来源的胡子鲇性别的鉴定方法。

3、本发明的最后一个目的在于提供上述引物或方法在不同来源的胡子鲇性别鉴定中的应用以及在胡子鲇单性育种中的应用。

4、本发明的上述第一个目的可以通过以下技术方案来实现：一种检测不同来源胡子鲇性别特异snp分子标记的引物，所述引物包括正向引物f和反向引物r，其中所述正向引物f的序列如seq id no:3所示，所述反向引物r的序列如seq id no:4所示，所述引物用于检测不同来源的胡子鲇性别特异的snp分子标记，所述snp分子标记位于如seq id no:1所示序列的第11,946位，其碱基为a或c，其中cc基因型为雌鱼，a/c基因型为雄鱼。

5、本发明开发了一种胡子鲇性别决定基因，所述基因的碱基序列如seq id no:1所示。

6、本发明通过胡子鲇性别qtl定位和全基因组测序的方法，确定了性别决定候选基因所在区间，并对性别决定候选基因进行克隆和研究。

7、本发明在定位的区间内发现了一个与性别关联的基因，其碱基序列如seq id no:1所示。

8、本发明申请人还进一步利用胡子鲇基因组重测序技术和转录组数据比对筛选了性别相关基因上与性别强相关的snp分子标记。

9、所述与胡子鲇性别特异的snp分子标记，所述snp分子标记位于如seq id no:1所示序列的第11,946位，其碱基为a或c，其中cc基因型为雌鱼，a/c基因型为雄鱼。

10、即本发明所述snp分子标记位于如seq id no:1所示基因序列的第11,946位，其中雌鱼为cc基因型，雄鱼为a/c基因型。

11、因此，本发明提供了一种与胡子鲇性别相关的snp分子标记，所述snp分子标记位于上述胡子鲇性别决定候选基因的第11,946位，其碱基为a或c，其中雌鱼为cc基因型，雄鱼为a/c基因型。

12、最终，本发明还设计了检测不同来源胡子鲇性别特异snp分子标记的引物，所述引物包括正向引物f和反向引物r，其中所述正向引物f的序列如seq id no:3所示，所述反向引物r的序列如seq id no:4所示。

13、具体地：

14、正向引物f：5’-acctgtatgtctgtggactgtg-3’(即seq id no：3所示的序列)；

15、反向引物r：5’-gccattcttgaagtaccgcttg-3’(即seq id no：4所示的序列)。

16、本发明的上述第二个目的可以通过以下技术方案来实现：一种不同来源的胡子鲇性别的鉴定方法，包括以下步骤：

17、(1)提取待测胡子鲇鳍条组织的dna；

18、(2)采用上述的引物，以步骤(1)提取的胡子鲇dna为模板，进行pcr扩增；

19、(3)采用毛细管电泳法检测扩增产物，根据测序峰型结果鉴定雌雄个体，其中杂合峰型为雄性个体，纯合峰型为雌性个体。

20、因此，本发明基于基因组重测序及转录组数据比对开发出了基因内snp分子标记及引物，并开发了利用该引物对胡子鲇遗传性别辅助鉴定的方法。

21、优选地，步骤(2)中pcr扩增时，采用的pcr反应体系包括：30ng/μldna模板：1.0μl，2×easypcr super mix：12.5μl，10mm正向引物f和反向引物r各1μl，dd h2o 9.5μl，总共25μl。

22、优选地，步骤(2)中pcr扩增时，pcr反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸30sec，循环35次，72℃延伸10min。

23、本发明的上述第三个目的可以通过以下技术方案来实现：上述引物在不同来源的胡子鲇性别鉴定中的应用。

24、进一步地，本发明还公开了上述的引物在胡子鲇单性育种中的应用。

25、本发明还提供了上述方法在不同来源的胡子鲇性别鉴定中的应用。

26、进一步地，本发明还公开了上述方法在胡子鲇单性育种中的应用。

27、综上，本发明基于全基因组测序和qtl定位技术，成功鉴定了性别决定候选基因，并进一步开发了基因内snp分子标记及扩增所述snp分子标记的引物，此引物可用于不同来源的胡子鲇的遗传性别鉴定，对胡子鲇的单性育种提供了极大的生产应用价值。

28、本发明具有以下优点：

29、(1)本发明定位并克隆了胡子鲇性别决定候选基因，并进一步获得了基因内与胡子鲇性别相关的snp分子标记；

30、(2)本发明基于定位到的性别决定候选基因设计了基因内snp分子标记及扩增所述snp分子标记的引物，可以快速对雌、雄胡子鲇进行性别鉴定的辅助筛选的应用，进而对胡子鲇的单性育种提供了极大的生产应用价值；

31、(3)本发明设计的胡子鲇性别特异性snp分子标记位于性别决定候选基因外显子上，相比现有技术存在的问题(二)，该snp分子标记与性别连锁程度强，提高了准确性和适用性；

32、(4)本发明实现了在普通实验室任意群体来源的胡子鲇性别的批量检测。