一种Ano3基因敲除的非人哺乳动物模型的构建方法及其应用

本发明涉及生物医药，更具体地，涉及一种ano3基因敲除的非人哺乳动物模型的构建方法及其应用。

背景技术：

1、ano3是哺乳动物anoctiamin蛋白家族的成员，其是一种ca2+依赖的磷脂促翻转酶。人类anoctiamin家族蛋白具有一系列分子功能，在参与离子转运、磷脂翻转和调节其他膜蛋白起着重要作用。内源性ano3是位于细胞膜及胞质内质网上的膜蛋白，能够发挥ca2+依赖的磷脂促翻转酶和调节离子通道的作用。

2、ano3主要表达在神经组织中，尤其是神经元细胞中。其主要存在于纹状体、海马、皮层、背根神经节等。ano3可与离子通道相互作用，参与调控神经元兴奋性。ano3蛋白能够与钠激活的钾通道(kcnt1)直接相互作用，参与静息膜电位的维持，因此ano3蛋白通过提高钠离子通道的敏感性来抑制兴奋性，从而参与调控神经元的兴奋性。其次ano3蛋白具有磷脂促翻转酶，它能使磷脂在质膜上的不对称分布消失，以响应细胞内钙离子水平的小幅升高。功能研究已表明ano3具有钙离子激活的磷脂促翻转酶活性而缺少离子通道活性。ano3基因是热性惊厥、肌张力障碍等的重要致病基因。如何快速高效地构建ano3基因敲除小鼠动物模型，以促进相关疾病的研究，是目前亟待解决的问题。

3、因此，本领域迫切需要开发一种ano3基因敲除的非人哺乳动物模型。

技术实现思路

1、针对上述问题，本发明的目的是提供了一种ano3基因敲除的非人哺乳动物模型。

2、在本发明的第一方面提供了一种试剂，包括：

3、(a)基因编辑蛋白或其表达载体，所述基因编辑蛋白选自下组：casrx、cpf1、cas9、cas13a、cas13b、cas13c、或其组合；和

4、(b)sgrna或其表达载体，其中所述sgrna是引导所述基因编辑蛋白特异性结合ano3基因的rna。

5、另一优选例中，所述sgrna包括sgrna1和/或sgrna2，所述sgrna1的靶向核酸序列如seq id no:1所示，所述sgrna2的靶向核酸序列如seq idno:2所示。

6、在另一优选例中，所述sgrna引导基因编辑蛋白特异性结合于ano3基因的核苷酸序列。

7、在另一优选例中，所述组分(a)和/或(b)中的所述表达载体包括病毒载体。

8、在另一优选例中，所述的病毒载体选自下组：腺相关病毒(aav)、腺病毒、慢病毒、逆转录病毒、疱疹病毒、sv40、痘病毒、或其组合。

9、在另一优选例中，所述的病毒载体选自下组：慢病毒、腺病毒、腺相关病毒(aav)、或其组合，较佳地，所述载体为腺相关病毒(aav)。

10、在另一优选例中，所述试剂的剂型选自下组：冻干制剂、液体制剂、或其组合。

11、在另一优选例中，所述试剂的剂型为液体制剂。

12、在另一优选例中，所述试剂的剂型为注射剂型。

13、在另一优选例中，所述基因编辑蛋白的表达载体和sgrna的表达载体为同一载体或不同载体。

14、在另一优选例中，所述组分(a)与组分(b)的重量比为100:1-0.01:1，较佳地，10:1-0.1:1，更佳地，2:1-0.5:1。

15、在另一优选例中，所述组合物中，所述组分(a)的含量为0.0001-99wt％，较佳地，0.1-90wt％，更佳地，1-70wt％。

16、在另一优选例中，所述组合物中，所述组分(b)的含量为0.0001-99wt％，较佳地，0.01-90wt％，更佳地，0.1-70wt％。

17、在另一优选例中，所述组合物中，所述组分(a)和组分(b)占所述组合物总重的0.01-99.99wt％，较佳地0.1-90wt％，更佳地1-80wt％。

18、在本发明的第二方面提供了一种分离的细胞，所述的细胞经如第一方面所述的试剂处理，且所述细胞中ano3蛋白失活。

19、在另一优选例中，所述细胞的基因组中ano3基因转录本的第1个外显子至第13个外显子切除。

20、在另一优选例中，所述细胞包括体细胞、生殖细胞和/或胚胎干细胞。

21、在另一优选例中，所述细胞选自人、和/或非人哺乳动物的细胞。

22、在另一优选例中，所述胚胎干细胞还包括少于14天的胚胎、和/或受精卵。

23、在另一优选例中，所述细胞选自啮齿动物，如小鼠、和/或大鼠。

24、在另一优选例中，所述细胞为小鼠的受精卵。

25、在本发明的第三方面提供了一种ano3基因敲除的非人哺乳动物的制备方法，包括以下步骤：

26、(m1)提供一种非人哺乳动物的细胞，将所述细胞中ano3基因转录本的第1个外显子至第13个外显子切除，得到ano3蛋白失活的非人哺乳动物细胞；和

27、(m2)利用步骤(m1)中得到的ano3蛋白失活的细胞，制备得到ano3蛋白失活的非人哺乳动物。

28、在另一优选例中，所述细胞包括体细胞、生殖细胞和/或胚胎干细胞。

29、在另一优选例中，所述细胞包括如第二方面所述的细胞和/或使用如第一方面所述的试剂处理的细胞。

30、在另一优选例中，所述非人哺乳动物包括啮齿动物，如小鼠、和/或大鼠。

31、在另一优选例中，所述方法还包括：(m3)对步骤(m2)获得的非人哺乳动物进行杂交，通过基因型鉴定，从而获得ano3蛋白失活的纯合子代。

32、在另一优选例中，所述鉴定的引物对包括wt-f和/或wt-r和/或mut-r引物对，所述wt-f的核苷酸序列如seq id no:3所示：gtcaggacagatgccagcttcacc；所述wt-r的核苷酸序列如seq id no:4所示：gatgcagagcgggatgtggtgc；所述mut-r的核苷酸序列如seq idno:5所示：ggggtattgcttaaggacatccacttcc。

33、在本发明的第四方面提供了一种ano3基因敲除的非人哺乳动物模型，其特征在于，所述非人哺乳动物模型利用如本发明第三方面所述的方法制备。

34、在另一优选例中，所述非人哺乳动物选自下组：啮齿动物(如小鼠、大鼠)。

35、在本发明的第五方面提供了一种用本发明第三方面所述的构建方法制备的非人哺乳动物模型或本发明第四方面所述的非人哺乳动物模型的用途，其特征在于，可用于筛选，以确定用于治疗或缓解热性惊厥、肌张力障碍相关疾病的潜在治疗剂。

36、应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

37、与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：

38、本发明提供了特异性靶向ano3基因的两条sgrna，利用cas9蛋白将ano3基因的exon 1-exon13敲除，所敲区域序列为非3倍数，造成移码突变，且敲除区域包含该基因编码区的70.59％，从而达到将该基因敲除的目的。使用crispr/cas9系统构建ano3基因敲除小鼠模型方法简单易行，周期短，拿到阳性小鼠的概率高，利用该小鼠模型可以用于研究多种疾病的致病机理，并为进一步开发此类疾病的治疗方式提供服务。