石蜡微球、组织细胞分离试剂及免疫刻蚀的方法与流程

本发明涉及免疫分析领域，尤其涉及石蜡微球、组织细胞分离试剂及免疫刻蚀的方法。

背景技术：

1、细胞是生命活动的基础，所有生物均由细胞构成。高等生命为生命活动，进行细胞分化，使得一种组织少则由数种细胞，多则由数十种细胞构成。这些细胞在空间上有序排列，且细胞体积较小，常规方法很难分别分析。

2、现有技术包括单细胞分离、显微切割等，显微切割术(microdissection)是90年代初发展起来的一门新技术，它能够从组织切片或细胞涂片上的任一区域内切割下几百个、几十个同类细胞，甚至单个细胞，再进行有关的分子生物学方面的研究，如pcr，pcr-sscp及比较基因组杂交等单细胞分离法是一种从待分离的材料中直接分离单个细胞进行培养获得纯培养的方法。该法在显微镜下操作，对于体积较大的微生物，可以用毛细管提取微生物个体；对较小的细胞或孢子，可以用显微针、钩、环等挑取以获得单细胞；也可将适当稀释后的样品制成小液滴，在显微镜下选取只含有一个细胞的液滴培养。

3、单细胞分离、显微切割均需要昂贵复杂的仪器，不利于技术的推广、应用及生命研究的进行。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了石蜡微球、组织细胞分离试剂及免疫刻蚀的方法。本发明提供了一种成本低、步骤简单、易于推广的组织细胞分析方法。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了石蜡微球，包括十八烷酸、石蜡和乙醇溶液；所述十八烷酸和所述石蜡的质量比为1:(10～100)。

4、在本发明的一些实施方案中，上述石蜡微球中，所述十八烷酸和所述石蜡的质量比为1:100。

5、在本发明的一些实施方案中，上述石蜡微球中，所述十八烷酸和所述石蜡的质量比为1:10。

6、在本发明的一些实施方案中上述石蜡微球中，所述石蜡的密度为0.9g/cm3。

7、在本发明的一些实施方案中上述石蜡微球中，所述乙醇的密度为0.9g/cm3。

8、在本发明的一些实施方案中上述石蜡微球中，所述乙醇的密度与与所述石蜡的密度相同，所述石蜡的液滴可以悬浮在溶液中；ph为碱性，可使所述十八烷酸去质子，使所述石蜡的液滴表面带负电，相互排斥，避免互溶。

9、在本发明的一些实施方案中上述石蜡微球中，所述乙醇的作用包括：其一，可使石蜡在该溶液中悬浮；其二，0.1mol/l naoh使十八烷酸去质子化，使石蜡液滴表面带有负电荷，阻止石蜡液滴融合。

10、在本发明的一些实施方案中上述石蜡微球中，所述石蜡微球的直径为200nm。

11、在本发明的一些实施方案中，上述石蜡微球中所述乙醇溶液的浓度为64％，所述乙醇溶液的溶质包括0.1mol/l的naoh。

12、本发明还提供了上述石蜡微球的制备方法，取所述十八烷酸与所述石蜡混合后，与所述乙醇溶液混合，获得所述石蜡微球。

13、在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中所述与所述乙醇溶液混合采用孔径为200nm的微流控芯片。

14、本发明还提供了组织分离试剂，包括上述石蜡微球或上述制备方法获得的石蜡微球和蛋白酶k。

15、在本发明的一些实施方案中，上述组织细胞分离试剂中所述石蜡的熔点低于所述蛋白酶k的消化温度。

16、在本发明的一些实施方案中，上述组织细胞分离试剂中所述石蜡的温度为58℃，所述蛋白酶k的消化温度为50℃。

17、在本发明的一些实施方案中，上述组织细胞分离试剂中所述蛋白酶k的浓度为10μg/ml。

18、在本发明的一些实施方案中，上述组织细胞分离试剂中所述蛋白酶k来源于天根的dna提取步骤是从dp316。

19、本发明还提供了上述石蜡微球、上述制备方法获得的石蜡微球或上述组织细胞分离试剂在免疫刻蚀中的应用。

20、本发明还提供了免疫刻蚀的方法，包括以下步骤：

21、s1：取上述石蜡微球或上述制备方法获得的石蜡微球活化后，标记二抗，获得二抗标记的石蜡微球；

22、s2：取所述二抗标记的石蜡微球融化后覆盖于预处理的样品，获得待测样品；

23、s3：取上述组织细胞分离试剂中的所述蛋白酶k消化所述待测样品，脱蜡，染色，获得分离的组织细胞。

24、在本发明的一些实施方案中，上述方法s2中所述预处理包括脱蜡、抗原修复和一抗孵育的步骤。

25、在本发明的一些实施方案中，上述方法中，所述一抗孵育的时间为1h。

26、在本发明的一些实施方案中，上述方法中，所述一抗包括小鼠抗人her2抗体。

27、在本发明的一些实施方案中，上述方法中，所述石蜡微球的直径为200nm。

28、在本发明的一些实施方案中，上述方法中，所述石蜡微球的粒径过大会导致石蜡微球漂浮在试剂表面，难以悬浮。

29、在本发明的一些实施方案中，上述方法s1中所述活化采用edc和nhs；所述edc的浓度为20mg/ml；所述nhs的浓度为24mg/ml。

30、在本发明的一些实施方案中，上述方法s1中所述活化的时间为30min，温度为37℃。

31、在本发明的一些实施方案中，上述方法s1中所述二抗包括兔抗小鼠抗体。

32、在本发明的一些实施方案中，上述方法s1中所述标记二抗采用抗原抗体反应。

33、在本发明的一些实施方案中，上述方法s1中所述标记二抗的时间为15min。

34、在本发明的一些实施方案中，上述方法s1中所述标记二抗后还包括过滤和清洗的步骤。

35、在本发明的一些实施方案中，上述方法s3中所述消化的温度为50℃，时间为30min。

36、在本发明的一些实施方案中，上述使用方法，所述蛋白酶k的消化温度低于所述石蜡的熔点，使得所述石蜡薄膜仍为固态，防止所述石蜡融化在浮力作用下脱离切片，失去保护功能。

37、在本发明的一些实施方案中，上述使用方法s2中所述取所述二抗标记的石蜡微球融化后覆盖于预处理的样品形成石蜡薄膜，保护组织不被消化。

38、本发明还提供了上述方法制得的切片。

39、本发明提供了石蜡微球及其制备方法、组织细胞分离试剂、石蜡微球和组织细胞分离试剂在免疫刻蚀中的应用以及免疫刻蚀的方法。

40、本发明提供了的免疫刻蚀的方法成本低、步骤简单、易于推广。

技术特征：

1.石蜡微球，其特征在于，包括十八烷酸、石蜡和乙醇溶液；所述十八烷酸和所述石蜡的质量比为1:(10～100)。

2.如权利要求1所述的石蜡微球，其特征在于，所述乙醇溶液的浓度为64％，所述乙醇溶液的溶质包括0.1mol/l的naoh。

3.如权利要求1或2所述的石蜡微球的制备方法，其特征在于，取所述十八烷酸与所述石蜡混合后，与所述乙醇溶液混合，获得所述石蜡微球。

4.组织细胞分离试剂，其特征在于，包括如权利要求1或2所述的石蜡微球或如权利要求3所述制备方法获得的石蜡微球和蛋白酶k。

5.如权利要求4所述的组织细胞分离试剂，其特征在于，所述石蜡的熔点低于所述蛋白酶k的消化温度。

6.如权利要求4或5所述的组织细胞分离试剂，其特征在于，所述蛋白酶k的浓度为10μg/ml。

7.如权利要求1或2所述的石蜡微球、如权利要求3所述制备方法获得的石蜡微球或如权利要求4至6任一项所述组织细胞分离试剂在免疫刻蚀中的应用。

8.免疫刻蚀的方法，其特征在于，包括以下步骤：

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，s2中所述预处理包括脱蜡、抗原修复和一抗孵育的步骤。

10.如权利要求8或9所述方法制得的切片。

技术总结本发明涉及免疫分析领域，尤其涉及石蜡微球、组织细胞分离试剂及免疫刻蚀的方法。本发明提供了石蜡微球，包括十八烷酸、石蜡和乙醇溶液；所述十八烷酸和所述石蜡的质量比为1:(10～100)。本发明提供了一种成本低、步骤简单、易于推广的组织细胞分析方法。技术研发人员：孙开宇受保护的技术使用者：上海欣戈赛生物科技有限公司技术研发日：技术公布日：2024/10/10