一种基于RPA-CRISPRCas12a平台和微流控芯片的高通量检测方法

本发明属于核酸分子靶标检测，更具体地涉及一种基于rpa-crisprcas12a平台和微流控芯片的高通量检测方法。

背景技术：

1、农业生物安全因子已成为人们关注的焦点和世界健康问题之一。随着农产品产业的快速发展，及时的对生产过程中的农产品进行生物安全因子的检测是很有必要的。传统检测方法已不能满足市场对高通量、高速、高效检测的需求，也不适合现场快速检测。因此迫切需要开发具有高灵敏度和高特异性的新型、快速和多功能的现场检测(poct)诊断应用的技术，用于农业全产业链中对农业生物安全因子的质控检测，以及清洁和卫生实践的监测。

2、近年来，crispr/cas内切酶检测系统因其高灵敏度、特异性和低成本而在分子诊断领域显示出广阔的前景。目前已经有大量基于crispr/cas系统结合核酸扩增技术用于安全因子的快速检测，在poct领域具有很大的应用潜力。本研究基于核酸靶标等温扩增技术和聚类规律间隔短回文重复序列(crispr)cas12a精准识别体系，结合高通量微流控芯片，建立快速、高效和便携的技术体系及检测方法。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种微流控芯片以及一种基于rpa-crisprcas12a平台和微流控芯片的高通量检测方法，从而解决现有技术迫切需要一种具有高灵敏度和高特异性的新型、快速和多功能的现场检测诊断方法的问题。

2、为了解决上述问题，本发明采用以下技术方案：

3、根据本发明的第一方面，提供一种微流控芯片，包括：上层结构、下层结构、推杆、第一反应室、第二反应室；其中，所述上层结构具有长方体形结构，包括：一个自后端朝向前端延伸的推杆容纳腔，在所述推杆容纳腔的前端沿竖直方向贯穿延伸的加样孔，以及设置于前端面的四个上层出口；所述下层结构具有长方体形结构，包括：在其顶面延伸的流道，所述顶面与所述上层结构的底面配合，所述流道包括一条主流道以及通过两次分流形成的四条分支流道，所述主流道的入口位置与所述上层结构中的加样孔底部在竖直方向上对准，所述四条分支流道的末端设有沿竖直方向贯穿延伸的下层出口；所述第一反应室由连成一排的四根第一pcr反应管构成，这四根第一pcr反应管在所述下层结构的底部分别与四个所述下层出口连接；以及所述第二反应室由连成一排的四根第二pcr反应管构成，这四根第二pcr反应管在所述上层结构的前端分别与四个所述上层出口连接；其中，通过上下翻转所述微流控芯片以及推动推杆，即可实现液体从第一反应室到第二反应室的流动。

4、优选地，所述上层结构与所述下层结构通过胶水粘接。

5、优选地，所述上层结构的底部设有分别与所述下层结构中的四个所述下层出口对准的四个凹槽，所述四个凹槽分别通过一根上层流道与四个上层出口连通。

6、优选地，所述推杆与所述推杆容纳腔的内壁过盈配合，在外力作用下推动所述推杆即可实现液体推送。

7、优选地，所述上层结构和所述下层结构由pmma材料制成。

8、优选地，所述上层结构前端的四个上层出口和所述下层结构底部的四个下层出口分别呈一条直线排列。

9、根据本发明的第二方面，提供一种基于rpa-crisprcas12a平台和微流控芯片的高通量检测方法，包括以下步骤：s1：提供一种如权利要求1-6中任意一项所述的微流控芯片，在第一反应室中装入rpa反应体系，在第二反应室中装入crispr/cas12a反应体系；s2：将待测样品和mgoac混合均匀后自上层结构的加样孔进样，推动推杆使液体进入下层结构的流道中，直到进入所述第一反应室，然后将所述第一反应室置于金属浴中38-42℃孵育8-12min，进行rpa扩增反应；s3：将所述微流控芯片翻转使第一反应室中的液体落入所述上层结构底部的凹槽中，推动推杆使rpa产物沿上层流道进入所述第二反应室中，然后将所述第二反应室置于金属浴中38-42℃孵育8-12min，进行crispr/cas12a反应；s4：使用便携紫外手电和滤光片对结果进行分析。

10、所述第一反应室的四根第一pcr反应管中分别加入针对一种检测靶标设计的rpa引物，所述第二反应室的四根第二pcr反应管分别加入针对一种检测靶标设计的crrna，从而最终实现对四个检测靶标的同时检测。

11、当所述高通量检测方法用于hly、tlh、nuc和rfbe基因的同时检测时，针对hly、tlh、nuc和rfbe基因设计的rpa引物序列分别如seq id no.1-2、seq id no.4-5、seq idno.7-8、seq id no.10-11所示，针对hly、tlh、nuc和rfbe基因设计的crrna序列分别如seqid no.3、6、9、12所示。

12、步骤s3中，向第二反应室中加入rpa产物的量为6μl时，检测灵敏度最高。

13、应当知晓的是，在wu等人提出的一种基于raa-crispr/cas13a双信号放大的高通量微流控策略检测单增李斯特氏菌的研究中，需要通过将试剂加入加样口后放入旋转器中，将试剂加入到反应室，随后进行冷冻干燥，步骤繁琐，方法复杂，而本发明只需要通过安装或更换由pcr管构成的反应室即可将试剂加入到反应体系中，无需提前包埋、冷冻干燥等操作。本发明设计的芯片，无需提前包埋试剂，两个反应室均可以方便地拆卸下来，便于操作。

14、还已知的是，现有技术中公开了一种基于毛细管力的微流控的检测方法，然而这类非自驱力的芯片需要连接泵，以达到让液体在芯片内流动的目的，然而这些必需装置并不利于现场检测。本发明通过设计这样一种自驱力多重检测微流控芯片，在检测中利用液体的自重实现液体驱动完成检测。因此，本发明相对于该现有技术来说实现了自驱力，省却了泵等外部动力装置，且无需连接检测仪器如质谱光谱等，同时更快速、更省时。

15、综上所述，根据本发明提供的一种微流控芯片以及一种基于rpa-crisprcas12a平台和微流控芯片的高通量检测方法，构建了一种同时检测四种病原微生物的新方法(rpa-crispr/cas12a-sdmc)，即使样品中同时含有四种靶标，检测结果也不存在交叉干扰，具有良好的稳定性、准确性和重复性。同时，该方法对细菌纯培养的lod可以达到10cfu/ml。对于rfbe基因和tlh基因的检测灵敏度达到10fg/μl，hly基因和nuc基因的检测灵敏度均为100fg/μl，因此该检测方法具有较高灵敏度。整个检测过程在40min内完成，本发明所设计的微流控芯片为自驱力芯片，无需与泵等仪器连接且结果不需要仪器分析，因此该方法满足poct。此外，该方法比单检方法省时，操作简单。在核酸分子靶标检测技术领域具有广阔的应用前景，简化食品检测监管流程，节省人力物力。

技术特征：

1.一种微流控芯片，其特征在于，包括：上层结构、下层结构、推杆、第一反应室、第二反应室；其中，

2.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述上层结构与所述下层结构通过胶水粘接。

3.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述上层结构的底部设有分别与所述下层结构中的四个所述下层出口对准的四个凹槽，所述四个凹槽分别通过一根上层流道与四个上层出口连通。

4.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述推杆与所述推杆容纳腔的内壁过盈配合，在外力作用下推动所述推杆即可实现液体推送。

5.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述上层结构和所述下层结构由pmma材料制成。

6.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述上层结构前端的四个上层出口和所述下层结构底部的四个下层出口分别呈一条直线排列。

7.一种基于rpa-crisprcas12a平台和微流控芯片的高通量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

8.根据权利要求7所述的高通量检测方法，其特征在于，所述第一反应室的四根第一pcr反应管中分别加入针对一种检测靶标设计的rpa引物，所述第二反应室的四根第二pcr反应管分别加入针对一种检测靶标设计的crrna，从而最终实现对四个检测靶标的同时检测。

9.根据权利要求7所述的高通量检测方法，其特征在于，当所述高通量检测方法用于hly、tlh、nuc和rfbe基因的同时检测时，针对hly、tlh、nuc和rfbe基因设计的rpa引物序列分别如seq id no.1-2、seq id no.4-5、seq id no.7-8、seq id no.10-11所示，针对hly、tlh、nuc和rfbe基因设计的crrna序列分别如seq id no.3、6、9、12所示。

10.根据权利要求7所述的高通量检测方法，其特征在于，步骤s3中，向第二反应室中加入rpa产物的量为6μl时，检测灵敏度最高。

技术总结本发明公开了一种微流控芯片以及一种基于RPA‑CRISPRCas12a平台和微流控芯片的高通量检测方法。包括以下步骤：S1：提供一种微流控芯片，在第一、第二反应室中分别装入RPA、CRISPR/Cas12a反应体系；S2：将待测样品自加样孔进样，推动推杆使液体进入下层结构中，直到进入第一反应室，进行RPA扩增反应；S3：翻转微流控芯片以及推动推杆使RPA产物进入第二反应室，进行CRISPR/Cas12a反应；S4：使用便携紫外手电和滤光片对结果进行分析。本发明构建了一种可同时检测四种病原微生物的新方法，样品中含有四种靶标，检测结果不存在交叉干扰，具有良好的稳定性、准确性和重复性以及高灵敏度。技术研发人员：王金斌,曾海娟,徐丹红,刘华,张岩,李柚,白寅霜,马娟,雒嘉炜受保护的技术使用者：上海市农业科学院技术研发日：技术公布日：2024/9/29