一种抗人Siglec-9微纳抗体及其应用的制作方法

本发明属于生物医药，具体涉及一种抗人siglec-9微纳抗体及其应用。

背景技术：

1、siglecs是唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素，主要由免疫细胞表达，被认为通过聚糖识别促进细胞-细胞相互作用并调节先天性和适应性免疫系统中细胞的功能。siglec家族包含至少15个在哺乳动物中发现的成员(pillai等人，annu rev immunol.，2012，30：357-392)。这些成员包括siglec-1，cd22(siglec-2)，cd33(siglec-3)，siglec-4，siglec-5，obbp1(siglec-6)，airm1(siglec-7)，saf-2(siglec-8)和cd329(siglec-9)。siglec-9属于cd33相关的siglecs，由siglec9基因编码，主要表达于人中性粒细胞、单核细胞、自然杀伤细胞以及t和b淋巴细胞。在功能上，siglec-9已被证明是一种抑制性受体。与cd33相关siglecs的其他成员一样，siglec-9具有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(itims)和itim样结构域，该结构域在细胞活化后迅速磷酸化，这导致酪氨酸磷酸酶的募集和活化，包括含有src同源性-2结构域的酪氨酸磷酸酶(shp)-1和shp-2。研究发现，靶向siglec-9的抗体可以诱导中性粒细胞死亡或抑制lps诱导的巨噬细胞活化，通过表达siglec-9抑制t细胞活化。此外，siglec-9的激动剂可以阻断中性粒细胞的活化和netosis，从而阻止严重covid-19的呼吸损伤和死亡。siglec-9配体在人气道和气道细胞中大量表达，在慢性鼻窦炎患者的气道中siglec-9的配对表达更是显著上调，提示配体在发炎细胞和组织中的表达有助于控制气道炎症。因此，siglec-9是一个慢性阻塞性肺疾病的潜在治疗靶点，靶向siglec-9的激动型抗体是潜在的治疗药物。

2、单域抗体是骆驼、鲨鱼等动物体内免疫球蛋白的一部分片段，具有完整的抗原识别与结合能力。1993年，hamers-casterman等偶然发现了一种天然缺失轻链的新型抗体，即重链抗体(heavy chain antibodies,hcabs)。1995年之后，又相继在未免疫及免疫的铰口鲨，大星鲨等软骨鱼纲发现了与hcabs相似的无轻链的免疫球蛋白新抗原受体(ig newantigen receptor,ignar)。随后，研究人员又分别从骆驼和鲨鱼的重链可变区库中淘选到只含有一个结构域的最小单元抗原结合片段，被称为单域抗体(single-domainantibodies,sdabs)。驼源的单域抗体被称为纳米抗体(nanobodies,nbs)，而鲨源的单域抗体比驼源更小20％左右，将其命名为微纳抗体(vnarbodies，vbs)。与传统iggs抗体相比，单域抗体理化性质更稳定，其cdr3向外伸展形成“指凸”结构，能够识别常规抗体无法到达的比较狭小的抗原表位，更加耐酸碱，热稳定性和化学稳定性高，即便在95℃下加热一小时，仍然能够保持一定的活性。此外，鲨鱼体内含有高浓度的尿素，鲨鱼微纳抗体耐受这么高浓度的尿素而不变性，具有更加稳定的理化性质。对于呼吸道疾病的治疗，鼻喷或吸入制剂更容易将药物运送至炎症部位，通过局部给药，副作用更小。因此，基于纳米/微纳抗体的优良特性，适合开发成鼻喷或吸入制剂。

3、综上所示，提供一种可以抑制嗜中性粒细胞、t淋巴细胞活性的抗人siglec-9微纳抗体，对于预防和/或治疗与t淋巴细胞、嗜中性粒细胞、巨噬细胞相关的疾病具有重要意义。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明提供了一种抗人siglec-9微纳抗体及其应用。

2、本发明采用以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种抗人siglec-9微纳抗体，所述抗人siglec-9微纳抗体的互补决定区由cdr1和cdr3组成；

4、所述cdr1为seq id no.1所示的氨基酸序列，所述cdr3为seq id no.5或seq idno.6所示的氨基酸序列；

5、或，所述cdr1为seq id no.2所示的氨基酸序列，所述cdr3为seq idno.7、seq idno.8、seq id no.9或seq id no.10所示的氨基酸序列；

6、或，所述cdr1为seq id no.3所示的氨基酸序列，所述cdr3为seq id no.11所示的氨基酸序列；

7、或，所述cdr1为seq id no.4所示的氨基酸序列，所述cdr3为seq id no.12所示的氨基酸序列。

8、优选地，所述抗人siglec-9微纳抗体还包括高变区hv2和hv4；

9、所述hv2为seq id no.13或seq id no.14所示的氨基酸序列；

10、所述hv4为seq id no.15或seq id no.16所示的氨基酸序列。

11、优选地，所述抗人siglec-9微纳抗体还包括骨架区fr1、fr2、fr3a、fr3b和fr4；

12、所述fr1为seq id no.17、seq id no.18、seq id no.19或seq id no.20所示的氨基酸序列；

13、所述fr2为seq id no.21、seq id no.22或seq id no.23；

14、所述fr3a为seq id no.24或seq id no.25所示的氨基酸序列；

15、所述fr3b为seq id no.26所示的氨基酸序列；

16、所述fr4为seq id no.27、seq id no.28、seq id no.29、seq id no.30或seq idno.31所示的氨基酸序列。

17、优选地，所述抗人siglec-9微纳抗体为seq id no.32、seq id no.33、seq idno.34、seq id no.35、seq id no.36、seq id no.37、seq id no.38或seq id no.39所示的氨基酸序列。

18、seq id no.1：gssrplgs。

19、seq id no.2：gsscplgs。

20、seq id no.3：gsvgplgs。

21、seq id no.4：gssftlca。

22、seq id no.5：eayawdtagmkgtvtle。

23、seq id no.6：eayswdtagmkgtvtle。

24、seq id no.7：eafscpqlgrwegiyawy。

25、seq id no.8：eayscrdnwdvapgiydyy。

26、seq id no.9：eayschswdespgvydyy。

27、seq id no.10：eayscpqlgrwegvyawy。

28、seq id no.11：eayswvtagmkgtvtle。

29、seq id no.12：kayclwddvspswdyy。

30、seq id no.13：atkkasls。

31、seq id no.14：atkkesls。

32、seq id no.15：ntasks。

33、seq id no.16：nkasks。

34、seq id no.17：arveqtpttttkeagesltincvlk。

35、seq id no.18：arleqtpttttkeagesltincvlk。

36、seq id no.19：qrleqtpttttkeagesltincvlk。

37、seq id no.20：erleqtpttttkeagesltincvlk。

38、seq id no.21：tywyftkkg。

39、seq id no.22：tnwyftkkg。

40、seq id no.23：tfwyftkkg。

41、seq id no.24：tggrysdtk。

42、seq id no.25：nggryaetv。

43、seq id no.26：fslrisdlrvedsgtyhc。

44、seq id no.27：lgggtiltvn。

45、seq id no.28：egggttltvk。

46、seq id no.29：egggtlltvn。

47、seq id no.30：lgggtlvtvk。

48、seq id no.31：lgggttltvn。

49、seq id no.32：

50、arveqtpttttkeagesltincvlkgssrplgstywyftkkgatkkaslstggrysdtkntasksfslrisdlrvedsgtyhceayawdtagmkgtvtlelgggtiltvn。

51、seq id no.33：

52、arveqtpttttkeagesltincvlkgsscplgstywyftkkgatkkaslstggrysdtkntasksfslrisdlrvedsgtyhceayscrdnwdvapgiydyyegggttltvk。

53、seq id no.34：

54、arleqtpttttkeagesltincvlkgsscplgstnwyftkkgatkkaslstggrysdtkntasksfslrisdlrvedsgtyhceafscpqlgrwegiyawyegggtlltvn。

55、seq id no.35：

56、qrleqtpttttkeagesltincvlkgssrplgstywyftkkgatkkaslstggrysdtkntasksfslrisdlrvedsgtyhceayswdtagmkgtvtlelgggtlvtvk。

57、seq id no.36：

58、arleqtpttttkeagesltincvlkgsvgplgstywyftkkgatkkaslstggrysdtkntasksfslrisdlrvedsgtyhceayswvtagmkgtvtlelgggttltvn。

59、seq id no.37：

60、arveqtpttttkeagesltincvlkgsscplgstfwyftkkgatkkaslstggrysdtkntasksfslrisdlrvedsgtyhceayschswdespgvydyyegggttltvn。

61、seq id no.38：

62、erleqtpttttkeagesltincvlkgssftlcatywyftkkgatkkeslsnggryaetvnkasksfslrisdlrvedsgtyhckayclwddvspswdyyegggttltvk。

63、seq id no.39：

64、qrleqtpttttkeagesltincvlkgsscplgstnwyftkkgatkkas lstggrysdtkntasksfslrisdlrvedsgtyhceayscpqlgrwegvya wyegggttltvk。

65、第二方面，本发明提供一种核酸分子，所述核酸分子包括编码所述抗人siglec-9微纳抗体的核酸序列。

66、优选地，所述核酸分子包括seq id no.40、seq id no.41、seq id no.42、seq idno.43、seq id no.44、seq id no.45、seq id no.46或seq id no.47所示的核酸序列。

67、seq id no.40：

68、caacggcttgaacaaacaccgacaacgacaacaaaggaggcaggcgaatcactgaccatcaattgcgtcctaaaaggttccagccgtccattgggtagtacgtactggtatttcacaaaaaagggcgcaacaaagaaggcgagcttatcaactggcggacgatactcggacacaaagaatacggcatcaaagtccttttccttgcgaattagtgacctaagagttgaagacagtggtacatatcactgtgaagcgtatgcttgggatacagctgggatgaagggtactgtgactctggaattaggaggcggcacccttctgactgtgaat。

69、seq id no.41：

70、gaacgggttgaacaaacaccgacaacgacaacaaaggaggcaggcgaatcactgaccatcaattgcgtcctaaaaggttccagctgtccattgggtagcacgtactggtatttcacaaaaaagggcgcaacaaagaaggcgagcttatcaactggcggacgatactcggacacaaagaatacggcatcaaagtccttttccttgcgaattagtgacctaagagttgaagacagtggtacatatcactgtgaagcgtatagttgccgggacaactgggatgtggcgcctggaatttacgactattatgaaggaggcggcacccttgtgactgtgaaa。

71、seq id no.42：

72、gaacggcttgaacaaacaccgacaacgacaacaaaggaggcaggcgaatcactgaccatcaattgcgtcctaaaaggttccagctgtccattgggtagcacaaactggtatttcacaaaaaagggcgcaacaaagaaggcgagcttatcaactggcggacgatactcggacacaaagaatacggcatcaaagtccttttccttgcgaattagtgacctaagagttgaagacagtggtacatatcactgtgaagcgtttagttgcccacagttgggccggtgggaagggatatatgcctggtatgaaggaggcggcacccctctgactgtgaaa。

73、seq id no.43：

74、gaacgggttgaacaaacaccgacaacgacaacaaaggaggcaggcgaatcactgaccatcaattgcgtcctaaaaggttccagccgtccattgggtagtacgtactggtatttcacaaaaaagggcgcaacaaagaaggcgagcttatcaactggcggacgatactcggacacaaagaatacggcatcaaagtccttttccttgcgaattagtgacctaagagttgaagacagtggtacatatcactgtgaagcgtatagttgggatacagctgggatgaagggtactgtgactctggaattaggaggcggcaccattgtgactgtgaat。

75、seq id no.44：

76、caacggcttgaacaaacaccgacaacgacaacaaaggaggcaggcgaatcactgaccatcaattgcgtcctaaaaggttccgtcggtccattgggtagtacgtattggtatttcacaaaaaagggcgcaacaaagaaggcgagcttatcaactggcggacgatactcggacacaaagaatacggcatcaaagtccttttccttgcgaattagtgacctaagagttgaagacagtggtacatatcactgtgaagcgtatagttgggttacagctgggatgaagggtactgtgactcttgaattaggaggcggcaccactgtgactgtgaaa。

77、seq id no.45：

78、caacggcttgaacaaacaccgacaacgacaacaaaggaggcaggcgaatcactgaccatcaattgcgtcctaaaaggttccagctgtccattgggtagcacgttctggtatttcacaaaaaagggcgcaacaaagaaggcgagcttatcaactggcggacgatactcggacacaaagaatacggcatcaaagtccttttccttgcgaattagtgacctaagagttgaagacagtggtacatatcactgtgaagcgtatagttgccacagctgggatgagagtcctggagtatatgactattatgaaggaggcggcaccactgtgactgtgaat。

79、seq id no.46：

80、gaacggcttgaacaaacaccgacaacgacaacaaaggaggcaggcgaatcactgaccatcaattgcgtcctaaaaggttccagtttcactttgtgtgccacgtactggtatttcacaaaaaagggcgctacaaagaaggagagcttatcaaatggcggacgatacgcggaaacagtgaacaaggcatcaaagtccttttctttgcgaattagtgacctaagagttgaagacagtggtacatatcactgtaaagcgtattgcctttgggatgacgtttcgccgagctgggactattatgaaggaggcggcacccctgtgactgtgaaa。

81、seq id no.47：

82、gcacgggttgaacaaacaccgacaacgacaacaaaggaggcaggcgaatcactgaccatcaattgcgtcctaaaaggttccagctgtccattgggtagcacaaactggtatttcacaaaaaagggcgcaacaaagaaggcgagcttatcaactggcggacgatactcggacacaaagaatacggcatcaaagtccttttccttgcgaattagtgacctaagagttgaagacagtggtacatatcactgtgaagcgtatagttgcccacagttgggccggtgggaaggggtatatgcctggtatgaaggaggcggcacccctctgactgtgaat。

83、第三方面，本发明提供一种重组载体，所述重组载体包括所述的核酸分子；所述重组载体包含2-4条核酸分子，且核酸分子编码的氨基酸序列之间通过连接子连接。

84、所述的连接子包括以下序列：(g4s)x，(g4s)x－(g3s)y、aaa，as，其中x，y＝1，2，3，4，5，6，7，8，9，10。

85、优选地，所述连接子为ggggsgggs。

86、第四方面，本发明提供一种抗人siglec-9微纳抗体fc融合蛋白，所述融合蛋白从n端到c端的结构如下所示：

87、ab-l-fc；

88、ab-l-ab-l-fc；

89、其中，ab为第一方面所述的抗人siglec-9微纳抗体；l为连接子；fc为igg1、igg2、igg3或igg4的fc片段。

90、优选地，igg的fc片段为igg1。

91、优选地，所述连接子为as。

92、所述fc片段的氨基酸序列如seq id no.48所示。

93、所述融合蛋白的氨基酸序列如seq id no.49、seq id no.50、seq id no.51、seqid no.52、seq id no.53、seq id no.54、seq id no.55或seq id no.56所示。

94、seq id no.48：

95、epkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk。

96、seq id no.49：

97、arveqtpttttkeagesltincvlkgssrplgstywyftkkgatkkaslstggrysdtkntasksfslrisdlrvedsgtyhceayawdtagmkgtvtlelgggtiltvnasepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk。

98、seq id no.50：

99、arveqtpttttkeagesltincvlkgsscplgstywyftkkgatkkaslstggrysdtkntasksfslrisdlrvedsgtyhceayscrdnwdvapgiydyyegggttltvkasepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk。

100、seq id no.51：

101、arleqtpttttkeagesltincvlkgsscplgstnwyftkkgatkkaslstggrysdtkntasksfslrisdlrvedsgtyhceafscpqlgrwegiyawyegggtlltvnasepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk。

102、seq id no.52：

103、qrleqtpttttkeagesltincvlkgssrplgstywyftkkgatkkaslstggrysdtkntasksfslrisdlrvedsgtyhceayswdtagmkgtvtlelgggtlvtvkasepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk。

104、seq id no.53：

105、arleqtpttttkeagesltincvlkgsvgplgstywyftkkgatkkaslstggrysdtkntasksfslrisdlrvedsgtyhceayswvtagmkgtvtlelgggttltvnasepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk。

106、seq id no.54：

107、arveqtpttttkeagesltincvlkgsscplgstfwyftkkgatkkaslstggrysdtkntasksfslrisdlrvedsgtyhceayschswdespgvydyyegggttltvnasepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk。

108、seq id no.55：

109、erleqtpttttkeagesltincvlkgssftlcatywyftkkgatkkeslsnggryaetvnkasksfslrisdlrvedsgtyhckayclwddvspswdyyegggttltvkasepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk。

110、seq id no.56：

111、qrleqtpttttkeagesltincvlkgsscplgstnwyftkkgatkkaslstggrysdtkntasksfslrisdlrvedsgtyhceayscpqlgrwegvyawyegggttltvkasepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk。

112、第五方面，本发明提供一种重组细胞，所述重组细胞包括所述的核酸分子或所述的重组载体。

113、优选地，所述重组细胞为酵母细胞、哺乳动物细胞和大肠杆菌中的一种或至少两种的组合。

114、优选地，所述酵母细胞为毕赤酵母、酿酒酵母和裂殖酵母中的一种或至少两种的组合。

115、优选地，所述哺乳动物细胞为cho细胞、hek293细胞或cos细胞。

116、第六方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包括第一方面所述的抗人siglec-9微纳抗体、第二方面所述的核酸分子、第三方面所述的重组载体、第四方面所述的抗人siglec-9微纳抗体fc融合蛋白或第五方面所述的重组细胞中的任意一种或至少两种的组合。

117、所述药物组合物含有：抗人siglec-9微纳抗体以及含有治疗哮喘、特应性皮炎、关节炎、过敏性鼻炎、湿疹和/或荨麻疹的其他药物，如皮质类固醇、奈多罗米钠、色甘氨酸、茶碱、白三烯受体拮抗剂、或其组合。

118、所述药物组合物为鼻喷、吸入、注射或涂抹剂型，优选地，所述剂型为鼻喷剂型。

119、第七方面，本发明提供如第一方面所述的抗人siglec-9微纳抗体、第二方面所述的核酸分子、第三方面所述的重组载体、第四方面所述的抗人siglec-9微纳抗体fc融合蛋白、第五方面所述的重组细胞或第六方面所述的药物组合物的应用，用于制备预防或治疗与t淋巴细胞、嗜中性粒细胞、巨噬细胞相关的疾病或病症的药物或制剂。

120、优选地，所述抗人siglec-9微纳抗体的用途，用于制备预防或治疗与t淋巴细胞、嗜中性粒细胞、巨噬细胞相关的疾病或病症的药物。

121、优选地，所述药物组合物用于制备预防和/或治疗与t淋巴细胞、嗜中性粒细胞、巨噬细胞相关的疾病或病症的药物。所述疾病或病症包括但不限于：过敏性鼻炎、哮喘、特异性皮炎、荨麻疹、慢性阻塞性肺疾病等。

122、本发明提供了抗人siglec-9微纳抗体的一种或多种的用途，具体用途如下：

123、1)用于制备预防和/或治疗与t淋巴细胞、嗜中性粒细胞、巨噬细胞相关的疾病或病症的药物；

124、2)用于检测人siglec-9分子；

125、3)用于流式检测；

126、4)用于细胞免疫荧光检测；

127、5)用于western blot检测。

128、采用上述技术方案后，本发明与背景技术相比，具有如下优点：

129、1、本发明的抗人siglec-9微纳抗体结合具有正确空间结构的人siglec-9蛋白，该抗人siglec-9微纳抗体是一种激动型抗体，可以抑制嗜中性粒细胞、t淋巴细胞活性，对于预防和/或治疗与t淋巴细胞、嗜中性粒细胞、巨噬细胞相关的疾病具有重要意义。

130、2、本发明的抗人siglec-9微纳抗体生产简便，制备成本较低。