抗人巨细胞病毒抗体及其用途的制作方法

本公开涉及对人巨细胞病毒具有特异性并以高亲和力结合的抗体或其抗原结合片段，以及产生这种抗体的制备方法。发明的抗体还具有中和感染的高效力。本发明还涉及所述抗体所结合的表位，以及所述抗体在感染个体中诊断、预防以及治疗的应用。

背景技术：

1、人类巨细胞病毒(human cytomegalovirus，hcmv)是一种无处不在的病原体，属于疱疹病毒科的β-疱疹病毒亚科，也被称为人类疱疹病毒5(hhv5)，通常主要在免疫功能正常的人群中表现为无症状感染，仅在免疫功能低下的人群中引起严重并发症。cmv感染在成人中的发病率差异很大，在发达国家占人口的36％到77％，而在发展中国家一般高于90％(1)。在免疫力低下的人群中，cmv的再感染或再活化可引起严重的并发症，甚至危及生命(2,3)。此外，先天性hcmv感染是造成0.7％的新生儿视力/听力缺陷或智力低下的主要原因(4,5)。

2、人类疱疹病毒的膜融合是一个复杂的过程，需要高度保守的包膜糖蛋白gb和gh/gl以及多种糖蛋白复合物来介导病毒对宿主细胞的附着、融合或内吞作用(6,7)。目前，hcmv糖蛋白gb的功能被认为是介导病毒与受感染细胞的膜融合的主要融合物，它是在三聚体或五聚体复合物与受体结合后触发的(8-10)。hcmv编码的两个关键的含gh/gl的复合物是进入细胞的必要条件。hcmv三聚体复合物由gh/gl/go形成，其中gl-cys144与go-cys351通过二硫键连接，hcmv五聚体复合物含有5个不同的亚单位gh/gl/ul128/ul130/ul131a，gl-cys144通过二硫键与ul128-cys162结合。因为三聚体中的go-cys351和五聚体中的ul128-cys162与gl-cys144有相同的结合点，所以五聚体和三聚体的形成是相互排斥的(11)。此外，病毒膜表面的五聚体和三聚体的比例受ul148和us16的调节(12,13)，最近显示ul116在感染细胞中gh复合物的组装和成熟过程中充当gh伴侣也影响gh复合物的形成(14,15)。遗传学研究明确阐明，五聚体是进入上皮细胞和内皮细胞所必需的，但不是进入成纤维细胞所必需的，更重要的是五聚体中的ul128/ul130/ul131a能维持hcmv对非成纤维细胞的趋向性(16,17)。相反，三聚体被认为足以介导cmv进入成纤维细胞。一些研究表明，go是维持无细胞病毒感染性的必要条件，go缺失的病毒既不感染成纤维细胞也不感染上皮和内皮细胞(18-20)。

3、hcmv于1956年首次被分离出来(21)，虽然实验性疫苗和治疗性单克隆抗体(mab)已进入临床试验，但目前仍没有批准用于临床的预防疫苗或治疗性单克隆抗体。到目前为止，cmv gb蛋白作为免疫原，mf59作为佐剂(gb/mf59)是临床试验中表现最好的cmv候选疫苗，在实体器官移植受者(sot)的ii期临床试验中，保护率为43％至50％(22)。化学药物如gcv、letermovir、mbv和cmv超免疫球蛋白(cmvig)对hcmv表现出疗效(23-25)。cmvig在sot或异体造血细胞移植后显示出良好的效果(26-28)。在怀孕前三个月的初次感染后，每两周一次的cmvig有效地防止了母婴hcmv的传播(29)。然而，目前的治疗方法由于毒性或对化学药物的耐药性以及血源性cmvig产品的缺点而受到严重限制(30,31)。基于mab的治疗具有克服目前现有药物局限性的优势，可以成为一种有效的临床替代方法。五聚体特异性mabs可以阻断hcmv对滋养细胞祖细胞的感染(32)，孕妇感染hcmv后30天内靶向pul128l的抗体水平增加与病毒传播给胎儿的风险降低有关(33)。此外，具有中和上皮细胞中cmv能力的mabs可以保护实体器官移植受者(34)。同时，gh特异性mabs显示出抑制病毒感染和传播的广谱特性(35)。最近的一项ii期临床试验表明，在高风险的肾移植受者中，用基因泰克公司的rg7667(包括五聚体特异性和抗gh抗体)接种疫苗可以推迟cmv病毒的出现时间，并且与安慰剂相比，cmv疾病更少(36)。因此，由五聚体特异性和gh特异性mabs组成的抗体鸡尾酒疗法可能会导致cmv免疫疗法的突破。然而，目前仍然没有获准的预防疫苗或治疗性单克隆抗体(mab)用于临床防治hcmv感染。

4、hcmv五聚体主要介导病毒感染上皮细胞、内皮细胞和免疫细胞等非成纤维细胞。针对五聚体的中和性抗体在抑制病毒感染非成纤维细胞的效果要强于针对gb蛋白的中和性抗体。因此未来将针对五聚体的中和性抗体与针对gb蛋白的中和性抗体进行联合用药，高效阻断病毒感染多种细胞类型，具有更大的潜在临床价值。

5、msl-109是ii期临床失败的针对hcmv gh/gl复合物的单克隆抗体，该抗体不能结合游离病毒，在临床上不能缓解cmv病毒血症(37)。抗体8i21在五聚体上的结合表位与五聚体与细胞相关受体结合的区域只有部分重叠(43)，8i21不能完全阻断病毒与细胞受体的结合，存在病毒突破感染的可能性。因此开发一个完全靶向五聚体与细胞受体结合区域的抗体，完全阻断病毒与细胞的结合，具有重要的临床意义。

技术实现思路

1、本公开鉴定和表征了一组8个hcmv五聚体反应的抗体，根据它们对cmv三聚体和五聚体的反应性，可以分为2组。第一组中的抗体pc0004、pc0010、pc0012、pc0014、pc0035和pc0037同时结合三聚体和五聚体。实验证明，第1组的6个抗体中的3个(pc0012、pc0014和pc0035)可以中和hcmv，并识别三聚体(trimer)和五聚体(pentamer)中gh/gl蛋白上的一个高度保守的结构域。这些抗体中和hcmv不是通过阻断cmv与宿主细胞的结合，而是通过抑制病毒进入宿主细胞的吸附后过程。第二组的抗体pc0031和pc0034只与五聚体结合。发明人发现2个五聚体特异性抗体中的一个(pc0034)通过阻断病毒对宿主细胞的吸附来中和hcmv。进一步的分析表明，在ncbi数据库目前收集的214个cmv基因组序列中，抗体pc0034针对的抗原位点在ul128和ul131a蛋白中是100％保守的。

2、本公开揭示了这两组强效中和抗体所针对的抗原表位上的关键残基，并为设计和开发三聚体和/或五聚体作为cmv疫苗提供了关于三聚体或五聚体复合物上中和表位的重要信息。本公开提供的强效中和mabs可以作为开发预防和治疗hcmv感染的“鸡尾酒”抗体疗法的有吸引力的候选抗体。

3、在一方面，本公开提供了一种抗人巨细胞病毒的抗体或其抗原结合片段，其包含选自下列的重链和轻链的cdr组合：

4、(1)分别包含seq id no.3-5的重链cdr1、cdr2及cdr3序列，和分别包含seq idno.8-10的轻链cdr1、cdr2及cdr3序列；

5、(2)分别包含seq id no.13-15的重链cdr1、cdr2及cdr3序列，和分别包含seq idno.18-20的轻链cdr1、cdr2及cdr3序列；

6、(3)分别包含seq id no.23-25的重链cdr1、cdr2及cdr3序列，和分别包含seq idno.28-30的轻链cdr1、cdr2及cdr3序列；

7、(4)分别包含seq id no.33-35的重链cdr1、cdr2及cdr3序列，和分别包含seq idno.38-40的轻链cdr1、cdr2及cdr3序列；

8、(5)分别包含seq id no.43-45的重链cdr1、cdr2及cdr3序列，和分别包含seq idno.48-50的轻链cdr1、cdr2及cdr3序列；

9、(6)分别包含seq id no.53-55的重链cdr1、cdr2及cdr3序列，和分别包含seq idno.58-60的轻链cdr1、cdr2及cdr3序列；

10、(7)分别包含seq id no.63-65的重链cdr1、cdr2及cdr3序列，和分别包含seq idno.68-70的轻链cdr1、cdr2及cdr3序列；和

11、(8)分别包含seq id no.73-75的重链cdr1、cdr2及cdr3序列，和分别包含seq idno.78-80的轻链cdr1、cdr2及cdr3序列。

12、在另一方面，本公开提供了编码前述抗体或其抗原结合部分的核酸。

13、在另一方面，本公开提供了包含前述核酸的载体。

14、在另一方面，本公开提供了包含前述核酸或载体的宿主细胞。

15、在另一方面，本公开提供了药物组合物，其包含前述抗体或其抗原结合部分、核酸、载体和/或细胞。

16、在另一方面，本公开提供了免疫缀合物，其包含前述抗体或其抗原结合片段和标记。

17、在另一方面，本公开提供了一种生成前述抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括培养包含编码前述核酸或表达载体的宿主细胞。

18、在另一方面，本公开提供了前述抗体或其抗原结合部分、核酸、载体、宿主细胞、或免疫缀合物用于制备检测、治疗、预防和/或减轻cmv感染或cmv相关疾病的药物组合物或试剂盒中的用途。

19、在另一方面，本公开提供了一种在人类个体中预防或治疗hcmv感染或hcmv相关疾病的方法，包括向需要治疗的个体给予有效量的前述抗体或其抗原结合部分、核酸、载体、宿主细胞、或免疫缀合物。

20、在另一方面，本公开提供了一种提高、增强或刺激感染hcmv的人类个体的抗性的方法，包括向有需要的个体给予有效量的前述抗体或其抗原结合部分、核酸、载体、宿主细胞、或免疫缀合物。

21、在另一方面，本公开提供了一种中和个体或样品中hcmv的方法，其包括将前述抗体或其抗原结合片段与个体或样品接触，并且测试前述抗体或其抗原结合片段结合以中和hcmv的能力。