一种单基因遗传病的携带者筛查基因组合、探针组合、试剂盒及其制备方法、装置与流程

本发明属于基因检测，具体涉及一种单基因遗传病的携带者筛查基因组合、探针组合、试剂盒及其制备方法、装置。

背景技术：

1、单基因遗传病是受一对等位基因控制的遗传病，目前已有8000多种被发现，其中有约1800为隐性遗传病，如遗传性耳聋、脊髓型肌肉萎缩症、地中海贫血等。

2、据统计，每个人平均携带了2.8个隐性遗传病的致病变异。隐性遗传病的发生通常是由于表型正常的父母同时携带致病基因，并将致病基因遗传给后代，导致后代发病。但由于父母表型正常，一般在怀孕前难以引起足够的重视，直到胎儿出现异常或出生后患病才被发现。大多数单基因遗传病会致死、致畸或致残，其中仅5％存在有效的治疗药物(orphandrug report 2020)，且治疗费用昂贵，给家庭和社会带来了沉重的精神和经济负担。而地中海贫血是世界上最常见的单基因遗传病之一，属于遗传性血红蛋白病。

3、早期的针对单基因遗传病的携带者筛查多为针对单一病种，甚至是单一基因上的少数几个位点。随着基因组变异数据库的完善以及新的致病基因和突变的不断被发现，携带者筛查需检测的疾病种类、基因数量、突变位点数量都在增加。市场上主要的检测技术为荧光定量pcr、多重连接探针扩增(mlpa)和一代测序等，此类方法检测通量低，范围小，灵敏性低，不适用于大人群的携带者筛查。

4、研究表明，与传统的筛查手段相比，使用高通量测序技术可以显著提高致病突变的检出率。近年来，高通量测序(ngs)发展和推广，其检测成本不断降低，性能的不断提高，让携带者筛查的可检测范围增加的同时得到更可靠的结果。

技术实现思路

1、本发明旨在提供一种基于高通量测序技术单基因遗传病的携带者筛查基因组合、探针组合、包含地贫检测的试剂盒装置，能够快速、准确地对目前已明确的单基因遗传病相关的致病突变进行检测。

2、本发明第一方面的目的，在于提供一种用于单基因隐性遗传病检测的探针组。

3、本发明第二方面的目的，在于提供一种用于单基因隐性遗传病检测的试剂盒。

4、本发明第三方面的目的，在于提供本发明第一方面的探针组或本发明第二方面的试剂盒在制备检测单基因隐性遗传病的产品中的应用。

5、本发明第四方面的目的，在于提供一种单基因遗传病基因筛查系统。

6、本发明第五方面的目的，在于提供一种用于单基因遗传病基因检测的装置。

7、本发明第六方面的目的，在于提供一种电子设备。

8、本发明第七方面的目的，在于提供一种存储介质。

9、为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

10、本发明的第一个方面，提供一种用于单基因隐性遗传病检测的探针组，所述探针组依据358个基因共4202个捕获区域设计获得，所述探针组具体序列见http://58.252.61.49:8003/probe/probe_sequence.txt。

11、本发明的第二个方面，提供一种用于单基因隐性遗传病检测的试剂盒，所述试剂盒含有本发明第一方面的探针组。

12、在本发明一些实施方式中，所述试剂盒还包含地贫大片段缺失检测试剂，包括如la taq dna polymerase、kapa 5×gc buffer、dntp stock等。

13、在本发明一些实施方式中，所述试剂盒还包括建库杂交试剂、杂交捕获磁珠。

14、本发明的第三个方面，提供本发明第一方面的探针组或本发明第二方面的试剂盒在制备检测单基因隐性遗传病的产品中的应用。

15、本发明的第四个方面，提供一种单基因遗传病基因筛查系统，所述筛查系统包括：指标输入模块和单基因遗传病基因评估模块；

16、所述指标输入模块至少包括采用本发明第一方面的探针组或本发明第二方面的试剂盒获取受试者血液和/或组织样本中目标基因的测序信息；

17、所述单基因遗传病评估模块包括至少包括将所述指标输入模块获取的测序结果进行生物信息分析，得到变异结果，输出受试者单基因遗传病基因的评估结果。

18、该单基因遗传病基因筛查系统的筛查流程图如图1所示。

19、在本发明一些实施方式中，所述指标输入模块包括使用以下方法得到受试者血液和/或组织样本中目标基因的测序信息：

20、(1)样品采集与提取：收集待测样品，提取基因组dna；

21、(2)dna片段化/末端修复/da尾：将所述基因组dna进行酶切、末端修复、da尾添加；

22、(3)接头连接：对步骤(2)得到的dna片段进行接头连接得到连接产物，对所述产物进行纯化；

23、(4)杂交前扩增：将步骤(3)中的纯化产物进行pcr扩增富集、纯化，获得用于杂交捕获的dna文库；

24、(5)探针捕获：将所述dna文库进行杂交前封闭，采用所述试剂盒中的探针组进行杂交捕获；

25、(6)洗脱及目标区域富集：磁珠与探针捕获产物孵育结合，孵育结束后进行洗脱，将洗脱回溶产物进行pcr扩增，获得富集的靶序列，获得待测序产物；

26、(7)测序及分析：将所述待测序产物进行二代测序，采用生物信息学分析测序结果；

27、和/或，采用地贫大片段缺失检测试剂对步骤(1)基因组dna进行检测。

28、在本发明一些实施方式中，步骤(3)中所述接头为y型接头，所述y型接头包括第一序列和第二序列，所述第一序列如seq id no:1所示，所述第二序列如seq id no:2所示。

29、在本发明一些实施方式中，在步骤(3)～(4)中，所述纯化为磁珠纯化。

30、在本发明一些实施方式中，所述pcr扩增富集的25μl反应体系为：纯化产物9～12μl，pcr扩增酶混合液10～15μl；和标签引物混合液1～3μl。

31、在本发明一些实施方式中，所述标签引物的正向序列如seq id no:3所示，反向序列如seq id no:4所示；index1、index2为标签引物，由8个特异性的碱基序列组成，用来识别不同样本，例如可以为：gcctatca、cttggatg、tcacagca、tcctacct。

32、在本发明一些实施方式中，所述pcr扩增富集的反应条件为97～99℃预变性05～2min；95～98℃变性5～30sec，58～62℃退火25～35sec，70～72℃延伸25～35sec，循环5～7次；70～72℃最终延伸4～5min；3～5℃保温。

33、在本发明一些实施方式中，步骤(6)中所述pcr扩增的体系为：洗脱回溶产物35～37μl；5×pcr扩增混合液8～11μl；捕获后扩增引物1～2μl；dna聚合酶1～2μl；dntp混合液0.5～1μl；

34、在本发明一些实施方式中，步骤(6)中所述pcr扩增的反应条件为：97～99℃预变性2～3min；97～99℃变性20～30sec，55～57℃退火20～30sec，70～72℃延伸1～2min，循环10～12次；70～72℃最终延伸8～12min；3～5℃保温。

35、在本发明一些实施方式中，步骤(7)中所述二代测序采用illumina二代测序平台novaseq6000进行。

36、在本发明一些实施方式中，所述生物信息学分析测序结果包括以下步骤：

37、1)数据质控及清洗：使用fastp软件进行数据质控和去接头等操作；

38、2)分子标签(umi)识别及序列比对：使用gatk标记umi后，使用bwa软件将预处理后的reads与人类参考基因组hg19进行比对；

39、3)数据质量校正：去除低质量reads(包括未匹配、匹配质量不好、多重匹配reads、由pcr扩增偏好引起重复序列等)；

40、4)变异检测：使用gatk软件进行变异检测，后续对假阳位点识别及过滤

41、5)变异注释：使用annovar软件，对发生变异的位点进行注释，获得其遗传学功能、人群携带频率、疾病相关性等信息。

42、本发明的第五个方面，提供一种用于单基因遗传病基因检测的装置，所述装置可利用本发明第一方面的探针组、本发明第二方面的试剂盒对待测样本进行测序文库构建，并对测序后产生的数据进行生物信息分析，得到变异结果。

43、在本发明一些实施方式中，所述生物信息学分析包括以下步骤：

44、1)数据质控及清洗：使用fastp软件进行数据质控和去接头等操作；

45、2)分子标签(umi)识别及序列比对：使用gatk标记umi后，使用bwa软件将预处理后的reads与人类参考基因组hg19进行比对；

46、3)数据质量校正：去除低质量reads(包括未匹配、匹配质量不好、多重匹配reads、由pcr扩增偏好引起重复序列等)；

47、4)变异检测：使用gatk软件进行变异检测，后续对假阳位点识别及过滤

48、5)变异注释：使用annovar软件，对发生变异的位点进行注释，获得其遗传学功能、人群携带频率、疾病相关性等信息。

49、本发明的第六个方面，提供一种电子设备，包括存储器、处理器及存储在存储器上并可在处理器上运行的计算机程序，所述处理器执行所述计算机程序时实现本发明第四方面的筛查系统的筛查过程。

50、本发明的第七个方面，提供一种存储介质，其中存储有处理器可执行的指令，所述处理器可执行的指令在由处理器执行时用于执行本发明第四方面的筛查系统的筛查过程。

51、本发明的有益效果是：

52、本发明提供针对明确致病性基因的捕获探针组合，可以一次性检测358个有重大临床价值的隐性遗传病相关的基因上的44074个致病突变，能够快速、准确地了解检测对象的致病突变携带情况，为孕前和孕早期夫妻提供生育指导。

53、本发明中提供的检测装置能使用生物信息分析方法对使用本发明中试剂盒所得的测序数据进行自动化分析、整理，协助临床工作者有针对性地进行变异解读，提高工作效率，为携带者筛查的大规模应用提供必要条件。