一种靶向HER2的纳米单克隆抗体及其制备方法和应用

本发明涉及生物医学，具体涉及一种靶向her2的纳米单克隆抗体idm3-59及其制备方法和应用。

背景技术：

1、激酶(rtk)，属于表皮生长因子受体(egfr/erbb)家族。编码her2的基因定位于人类染色体17q21，属于原癌基因，产物为185kd的跨膜蛋白，简称p185，是由1255个氨基酸组成的，包含四个胞外结构域和一个跨膜结构域。her2蛋白主要通过与her家族中的其他成员(包括egfr(herl/erbbi)、her3/erbb3、her4/erbb4)形成异二聚体而与各自的配体结合，从而激活下游信号通路，目前暂未发现能与其直接结合的配体。

2、her2蛋白介导的信号转导途径主要有ras/raf/mapk/pi3k以及akt等信号通路。her2与配体结合后，主要通过引起受体的二聚化以及胞浆内酪氨酸激酶区的自磷酸化，激活酪氨酸激酶的活性；其具有特殊的开放结构，可以在没有特定配体参与的情况下激活自身，因而能够与自身或her家族其他成员形成同源/异源二聚体，此外her2还是her家族成员异二聚体的首选伴侣，其参与形成的异二聚体活性常强于其它异二聚体。

3、her2在多种癌症中都有高度表达，目前已知的乳腺癌、胃癌、肺癌、子宫内膜癌等多种类型的癌症患者都会进行her2表达水平的检测。her2高表达在在乳腺癌中的检出率约为15％～25％，在胃癌检出率约为20％，在肺癌中的检出率约2.5％，而在子宫内膜癌中的检出率可以达到18％～80％。

4、her2的过表达可能导致受体酪氨酸激酶的持续增强激活从而引起一系列下游级联反应，如mapk、pi3k-pkb/akt、stat等。her2介导的信号通路还可以调节肿瘤相关基因的表达，从而促进肿瘤侵袭和转移。her2的过表达在某些浸润性癌症尤其是浸润性乳腺癌的发生和发展中起重要作用，因此her2已成为乳腺癌的重要生物学标志物和治疗靶点。

5、单克隆抗体曲妥珠单抗(trastuzumab，赫赛汀/herceptin)、帕妥珠单抗(pertuzumab，帕捷特/perjeta)、拉帕替尼(lapatinib，泰立沙/tykerb)、来那替尼(neratinib，nerlynx)、吡咯替尼(pyrotinib)是特异性靶向her2的抗体药物，主要用于her2阳性的浸润或转移性乳腺癌患者的治疗，通过靶向结合her2，抑制了her2与其它her家族成员的二聚化作用，从而抑制肿瘤生长；拉帕替尼、来那替尼和吡咯替尼在靶向抑制her2的同时还可靶向抑制her1(egfr/erbb1)，通过减少egfr和her2的自磷酸化，抑制下游的mapk和akt信号通路，从而抑制egfr或her2过表达肿瘤细胞的增殖。

6、传统抗体大多只能在哺乳动物表达系统中表达，生产工艺复杂且成本高，抗体稳定性欠佳，免疫原性较高且组织穿透力低，这些综合因素往往导致抗体的治疗效果不佳。相较于传统的抗体，纳米抗体(又被称为vhh单域抗体)具有诸多优势，其可在哺乳动物表达系统和大肠杆菌以及昆重表达系统中进行表达，产生的抗体通常具有较高的水溶性且稳定性强。纳米抗体是目前已知的具有完整抗体活性的最小的抗体结构模式，其分子量通常为常规抗体的1/10，这就决定了其具有较高的组织穿透能力，和较短的半衰期，可轻松穿透血脑屏障，且血清清除速度较快，因而纳米抗体克服了传统抗体的诸多缺点，这也使其更加适合携带放射性同位素。纳米抗体可以快速而具体地穿透肿瘤组织结合靶标，而非结合纳米体可以快速从血液中去除并减少身体的辐射剂量。与传统抗体相比，纳米抗体作为示踪剂和靶向内部放疗药物具有更多优势。

7、然而目前针对her2的靶向抗体药物缺乏切实有效的纳米抗体，因而开发出合适的靶向her2的抗体药物具有重要的研究和应用意义，应积极开发针对her2的新型有效的特异性纳米体药物。

技术实现思路

1、为了克服现有技术中的缺陷，本发明提供了一种靶向her2的纳米单克隆抗体idm3-59及其制备方法和应用。纳米抗体克服了传统抗体的缺点，具有分子量低、稳定性强、溶解性好、易表达、低免疫原性、渗透性和靶向性强，且生产成本低易表达纯化的特点，因而靶向her2的纳米抗体无疑将拥有更广泛的适用性，低免疫原性和强靶向性意味着同剂量抗体将拥有更低的机体负担和更高的治疗效果；纳米抗体组织渗透性，表明her2纳米抗体对于her2阳性的乳腺癌或胃癌等的晚期脑转移患者可能仍然适用。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、本发明的第一方面是提供一种靶向her2的纳米单克隆抗体，其互补决定区cdr包括cdr1、cdr2和cdr3；其中，cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列分别为gsifstyn、ltrdgva和ktlpltrdwgsad。

4、进一步地，上述纳米单克隆抗体的氨基酸序列为seq id no:4。

5、本发明的第二方面是提供一种嵌合抗原受体，其包括上述纳米单克隆抗体。

6、本发明的第三方面是一种核酸分子，其编码上述纳米单克隆抗体或嵌合抗原受体，其核苷酸序列例如如seq id no:5所示。

7、本发明的第四方面是提供一种核酸构建物，其包括上述核酸分子；优选地，该核酸构建物是克隆载体、表达载体或整合载体。

8、本发明的第五方面是提供一种宿主细胞，其表达和/或分泌上述纳米单克隆抗体或嵌合抗原受体，或包括上述核酸分子或核酸构建物。

9、本发明的第六方面是提供一种制备上述纳米单克隆抗体或嵌合抗原受体的方法，包括：在适合的条件下，培养上述宿主细胞，和任选的从培养物中纯化所述纳米单克隆抗体或嵌合抗原受体。

10、本发明的第七方面是提供一种药物组合物，其包括上述纳米单克隆抗体、嵌合抗原受体、核酸分子、核酸构建物、核酸分子、核酸构建物或宿主细胞；优选地，还包括药学上可接受的载体或赋形剂。

11、本发明的第八方面是提供上述纳米单克隆抗体、嵌合抗原受体、核酸分子、核酸构建物、核酸分子、核酸构建物或宿主细胞在制备预防或治疗肿瘤的药物或者诊断癌症或预测癌症治疗效果的试剂盒中的应用。

12、本发明的第九方面是提供一种检测her2的试剂盒，其包括上述纳米单克隆抗体、核酸分子、核酸构建物或宿主细胞；优选地，该试剂盒还包括用于检测her2与所述纳米单克隆抗体的结合的试剂；更优选地，所述检测结合的试剂是能与所述纳米单克隆抗体连接的可检测标记物。

13、本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：

14、本发明提供的纳米单克隆抗体对人her2蛋白具有较高的特异性，具有较强的亲和力，且易于生产、稳定性高，适用于各类靶向her2的癌症诊断与治疗研究。

技术特征：

1.一种靶向her2的纳米单克隆抗体，其特征在于，所述纳米单克隆抗体的互补决定区cdr包括cdr1、cdr2和cdr3；其中，cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列分别为gsifstyn、ltrdgva和ktlpltrdwgsad。

2.如权利要求1所述的纳米单克隆抗体，其特征在于，所述纳米单克隆抗体的氨基酸序列如seq id no:4所示。

3.一种嵌合抗原受体，其特征在于，包括如权利要求1或2所述的纳米单克隆抗体。

4.一种核酸分子，其特征在于，其编码如权利要求1或2所述的纳米单克隆抗体或如权利要求3所述的嵌合抗原受体，其核苷酸序列例如如seq id no:5所示。

5.一种核酸构建物，其特征在于，包括如权利要求4所述的核酸分子；优选地，所述核酸构建物是克隆载体、表达载体或整合载体。

6.一种宿主细胞，其特征在于，其表达和/或分泌如权利要求1或2所述的纳米单克隆抗体或如权利要求3所述的嵌合抗原受体，或包括如权利要求4所述的核酸分子或如权利要求5所述的核酸构建物。

7.一种制备如权利要求1或2所述的纳米单克隆抗体或如权利要求3所述的嵌合抗原受体的方法，其特征在于，包括：在适合的条件下，培养如权利要求6所述的宿主细胞，和任选的从培养物中纯化所述纳米单克隆抗体或嵌合抗原受体。

8.一种药物组合物，其特征在于，包括如权利要求1或2所述的纳米单克隆抗体、如权利要求3所述的嵌合抗原受体、如权利要求4所述的核酸分子、如权利要求5所述的核酸构建物或如权利要求6所述的宿主细胞；优选地，还包括药学上可接受的载体或赋形剂。

9.如权利要求1或2所述的纳米单克隆抗体、如权利要求3所述的嵌合抗原受体、如权利要求4所述的核酸分子、如权利要求5所述的核酸构建物或如权利要求6所述的宿主细胞在制备预防或治疗肿瘤的药物或者诊断癌症或预测癌症治疗效果的试剂盒中的应用。

10.一种检测her2的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1或2所述的纳米单克隆抗体、如权利要求4所述的核酸分子、如权利要求5所述的核酸构建物或如权利要求6所述的宿主细胞；优选地，所述试剂盒还包括用于检测her2与所述纳米单克隆抗体的结合的试剂；更优选地，检测所述结合的试剂是能与所述纳米单克隆抗体连接的可检测标记物。

技术总结本发明提供了一种靶向HER2的纳米单克隆抗体IDM3‑59及其制备方法和应用，所述纳米单克隆抗体的互补决定区CDR包括CDR1、CDR2和CDR3；其中，CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为GSIFSTYN、LTRDGVA和KTLPLTRDWGSAD。本发明提供的纳米单克隆抗体对人HER2蛋白具有较高的特异性，具有较强的亲和力，且易于生产、稳定性高，适用于各类靶向HER2的癌症诊断与治疗研究。技术研发人员：申思仙,孙磊受保护的技术使用者：复旦大学技术研发日：技术公布日：2024/9/2