编码HTNV包膜糖蛋白GP的基因、其编码的表达载体、mRNA分子及其用途

本发明属于核酸疫苗，具体涉一种编码htnv包膜糖蛋白gp的基因、重组该基因的表达载体、相关mrna分子及其用途。

背景技术：

1、汉坦病毒(htnv)是属于布尼亚病毒科正汉坦病毒属的负性rna病毒，是一种危害严重的人畜共患病原体，可引起肾综合征出血热(hfrs)和汉坦病毒肺综合征，以发热、出血和急性肾功能损伤为主要临床症状。据统计，每年有数千例hfrs病例，死亡率高达15％。

2、htnv三股单负链rna分为小(s)、中(m)和大(l)三个片段，m段编码病毒表面糖蛋白(gp)。gp可水解得到gn和gc分子，在htnvgp中，gn和gc在病毒的体液和细胞免疫过程中发挥重要的结合作用。在小鼠模型中接种重组htnv-gp可引起保护性免疫，并且利用htnvgp作为诱导t细胞应答的强效免疫原也已被证实。因此，针对gp研究策略被认为是治疗和预防htnv感染引起hfrs的有效方法。

3、核酸疫苗(包括dna和mrna疫苗)可进入人体细胞，并像病毒一样产生内源性抗原。核酸疫苗通过双重途径向免疫系统提供抗原，从而激活细胞和体液免疫反应，增强保护能力。mrna疫苗代表了核酸疫苗技术的重大进步。随着mrna疫苗在预防covid-19方面的临床应用，mrna疫苗在抗击各种烈性病原体方面已显示出巨大的潜力。然而，mrna疫苗在应对htnv方面的有效性和适用性仍是一个不确定的领域。值得注意的是，mrna疫苗技术的进步得益于假尿苷修饰和脂质纳米颗粒(lnp)递送系统。最近的研究表明，lnp对疫苗在注射部位的维持至关重要，可延长抗原呈递和先天性免疫细胞的免疫刺激。虽然lnp作为有效的抗原递送系统已在mrna疫苗领域得到充分开发，但仍需进一步研究以评估其在dna疫苗接种中针对各种传染病原的潜力。利用核酸疫苗技术在抗击病毒感染方面已被证实的潜力，开发一种专门针对汉坦病毒的安全有效的疫苗至关重要，这将成为应对这一严重病毒威胁的重要补充。

技术实现思路

1、鉴于以上技术问题，本发明提供一种编码htnv包膜糖蛋白gp的基因，利用该基因制备得到的三种候选核酸疫苗gpdna、lnp-gpdna和gpmrna能够诱导特异性细胞和体液免疫应答，具有抗htnv免疫保护效力。

2、本发明提供的具体技术方案如下：

3、本发明第一方面，提供一种编码htnv包膜糖蛋白gp的基因，其核苷酸序列seq idno.1所示，其密码子与htnv76-118株的m段核苷酸序列相比具有人源偏好性的特征。

4、本发明第二方面，提供一种所述基因在制备用于预防或治疗汉坦病毒相关疾病或感染的产品中的应用。

5、优选地，所述基因用于制备预防或治疗肾综合征出血热的产品。

6、上述产品为疫苗或药物。疫苗可包括疫苗佐剂或防腐剂，疫苗佐剂包括但不限于氢氧化铝、矿物油、吐温-80、弗氏不完全佐剂、人工合成的多聚肌苷酸、脂多糖、类酯、鲨烷等。防腐剂包括但不限于邻乙汞硫基苯酸钠、edta、硫柳汞、2-苯氧乙醇、氮仿等。

7、药物中可包括药学上可接受的辅料而被制备成适宜的制剂，如注射剂、口服制剂等。辅料根据具体的制剂类型进行选择，包括但不限于稀释剂、调节剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、抗氧化剂、防腐剂、ph调节剂、等渗或等张调节剂等。稀释剂选自淀粉、蔗糖、纤维素类、无机盐类等；乳化剂选自司盘类、吐温类、甘油脂肪酸酯、高级脂肪酸盐、阿拉伯胶、明胶、果胶、磷脂、琼脂、海藻酸钠、二氧化硅等；抗氧化剂选自亚硫酸盐、焦亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、抗坏血酸、没食子酸及其酯类等；防腐剂选自尼泊金类、有机酸及其盐、季铵类化合物、醋酸氯己定、醇类、酚类等；ph调节剂选自盐酸、硫酸、磷酸、酒石酸、醋酸、氢氧化钠、碳酸氢钠、乙二胺、葡甲胺、磷酸盐、醋酸盐、枸橼酸、枸橼酸盐等；等渗或等张调节剂选自葡萄糖、木糖醇、氯化钠、枸橼酸钠、山梨醇等。

8、本发明第三方面，提供一种表达载体，其包括所述基因。

9、优选地，所述表达载体是将所述基因插入pvax1载体的bamhi和xhoi位点之间构建得到。

10、本发明第四方面，提供一种mrna分子，其编码基因是在第一方面所述基因的基础上增加了utr区及聚腺苷酸poly(a)尾部所得，mrna分子的核苷酸序列seq id no.2所示。具体是在第一方面所述基因序列的5’端和3’端均增加utr序列，并在3’端增加poly(a)尾部。

11、其中，utr序列来源于智人血红蛋白亚基β，5’端的utr序列包括一个调节序列及β-珠蛋白的5’-utr序列，3’端的utr序列由β-珠蛋白的3’-utr的两个相同片段的串联序列组成。

12、优选地，所述聚腺苷酸(polya)尾长度为120nt。

13、进一步优选地，所述mrna分子是将其编码基因插入pgem-utr载体的ecori和xhoi位点之间构建得到体外表达载体，再对体外表达载体进行体外转录及加帽修饰得到；所述pgem-utr载体是将utr序列插入pgem载体的ecor i和xbai位点之间构建得到。

14、上述表达载体及mrna分子均可被用于制备预防或治疗汉坦病毒相关疾病或感染的产品。尤其可被用于制备预防或治疗肾综合征出血热的产品。该产品可以是疫苗或者药物。疫苗中可包括疫苗佐剂或递送载体或辅料。药物中可包括辅料而被制备成适宜的制剂。

15、本发明第五方面，提供一种预防或治疗肾综合征出血热的疫苗，该疫苗包括所述基因或所述表达载体或所述mrna分子，以及可接受的递送系统或佐剂或辅料。

16、优选地，所述疫苗是将所述表达载体封装在递送系统中，所述递送系统为脂质。

17、优选地，所述脂质是由可电离脂质、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、胆固醇及peg-脂质组成；以所述脂质体系的总摩尔量百分比计，各物质含量分别为：可电离脂质55％～60％、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱10％～15％、胆固醇30％～40％、peg-脂质1％～3％，上述各物质总摩尔量百分比之和为100％。

18、优选地，所述疫苗是按照以下步骤制备得到：

19、取可电离脂质(alc-0315)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dspc)、胆固醇和peg-脂质，以55：10：32.5：2.5的摩尔比溶解在乙醇中；

20、将10mm脂质混合物与含有dna疫苗的10mm柠檬酸盐缓冲液以体积比1：3的比例通过混合器混合。

21、将混合物转移到30倍体积的水性缓冲系统中，通过0.22μm网过滤，并使用50kd截留分子量的超滤管进行渗滤浓缩至所需浓度，即得所述疫苗。

22、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

23、1、本发明在htnv76-118株的m段核苷酸序列的基础上进行了人源偏好性密码子优化，相较htnv76-118株的m段原基因其具有提高蛋白转译质量、安全性强的优势。

24、2、本发明首次构建汉滩病毒mrna疫苗，该疫苗成功诱导了病毒特异性体液、细胞免疫应答并发挥有效的体内保护。

25、3、本发明利用脂质纳米颗粒包裹dna用于出血热病毒疫苗，与相同拷贝数的裸dna疫苗相比展示出更强大的细胞免疫反应。

26、4、本发明利用优化后的htnv76-118株的m段核苷酸序列及表达htnv包膜糖蛋白gp的mrna序列分别构建表达该分子的gpdna(pvax1-gphtnv)、lnp-gpdna和gpmrna三种核酸疫苗，进而利用其免疫小鼠，证明构建得到的疫苗具有抗汉坦病毒特异性细胞和体液免疫应答及抗病毒保护效力。