DSA-PPh3分子在制备循环肿瘤细胞检测试剂中的用途及检测试剂和试剂盒

本发明涉及生物医学领域，具体涉及dsa-pph3分子在制备循环肿瘤细胞检测试剂中的用途及检测试剂和试剂盒。

背景技术：

1、循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，ctcs)是从原发肿瘤或转移瘤中脱落的癌细胞，是肿瘤进展和转移的关键介质，循环肿瘤细胞有向远处扩散并形成新肿瘤的能力。相较于主要来源于死亡细胞的循环肿瘤dna、ctcs是一种活的细胞或细胞团，代表着最具攻击性、侵袭性或耐药性的细胞，包含肿瘤的基因组、转录组和蛋白组的信息，还能进一步扩大培养，提供药敏信息。ctcs基因组和表型图谱的系列分析、存活ctc群体的培养可以提供与肿瘤进展与治疗相关的动态分子特征，所以在肿瘤细胞复发、个性化治疗和精准诊疗等方面具有重要临床应用价值。所以，ctcs鉴定技术是目前ctcs研究的重要研究方向之一。

2、ctcs鉴定技术研究重要子研发方向之一为ctcs检测的特异性研究。循环肿瘤细胞富集过程中，其富集物中大量的白细胞给科研工作者提出了鉴定挑战，使用各种膜结合抗原和细胞质抗原的抗体进行免疫学鉴定是检测ctcs的主要方法。cellsearch系统中利用癌症生物标志物ck8、ck18、ck19以及白细胞特异性标志物cd45和细胞核染料dapi对ctcs进行检测和计数。然而，由于ck位于细胞内部，该标志物的使用需要配合固定液及穿透液，这会损害ctcs内的dna及rna。但ctcs分子特征有助于更好地了解转移过程的关键方面，并可作为促进个性化医疗方法的有价值的预后工具。因此，建立一个不损害ctcs分子特征的高效鉴定方法十分重要。肿瘤细胞相较于白细胞的一个突出不同就是无法控制的生长。而无法控制的细胞生长需要提高端粒酶活性。染色体末端的端粒是一种特殊的结构，可保护基因组完整性免遭降解、重排和端到端融合。端粒酶在正常体细胞中不活跃，但在大多数肿瘤细胞中高度激活，以维持其永生表型和无限增殖。因此，端粒酶活性具有成为鉴别肿瘤细胞与白细胞的有潜力的生物标志物。

3、但现有的端粒酶检测方法中，端粒重复序列扩增法存在操作繁琐且灵敏度较低等问题，电化学方法虽然具有操作简便、灵敏度高的优点，但其所涉及的电活性分子结构复杂，合成困难。其次，线粒体是真核生物中负责能量产生的重要细胞器。一般来说，线粒体通过离子泵和氧化途径维持脂质双层的恒定的膜电位(-180mv)，其幅度在任何其他细胞器中都是前所未有的。许多研究表明，肿瘤细胞中线粒体的代谢活动与正常细胞明显不同，因此肿瘤细胞膜比正常细胞膜带更多负电荷。situ等(situ b,ye x,zhao q,etal.identification and single-cell analysis of viable circulating tumor cellsby a mitochondrion-specific aie bioprobe[j].adv sci(weinh),2020,7(4):1902760.doi:10.1002/advs.201902760.)通过设计aie生物探针标记线粒体检测细胞荧光，可有效区分肿瘤细胞，对细胞活力和完整性影响很小，但该方法对于某些线粒体活性较低的肿瘤细胞无法达到较好的鉴定效果。因此，现有的鉴定技术限制了ctcs的临床推广应用。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明利用polya序列将端粒酶特异性识别的核酸序列tsp构建于金纳米颗粒(aunps)上，使其能够被有效地载入肿瘤细胞内。由于肿瘤细胞内端粒酶活性异常，tsp在此环境中可以得到延长，从而增加肿瘤细胞内的负电荷载位。同时，肿瘤细胞内的线粒体也表现出异常的代谢活性并带有负电荷。通过合成正电荷的聚集诱导发光(aggregation-induced emission，aie)荧光探针dsa-pph3，该方法能够实现对富集后ctcs的无损鉴定。因此，本发明提供dsa-pph3分子在制备循环肿瘤细胞检测试剂中的用途及检测试剂和试剂盒。

2、本发明提供的具体方案如下：

3、dsa-pph3分子在制备循环肿瘤细胞检测试剂中的用途，所述dsa-pph3分子的结构式如下所示：

4、

5、其中，所述dsa-pph3分子为两端修饰正电荷三苯基膦盐(tpp)基团的二苯乙烯基蒽(9,10-distyrylanthracene，dsa)。

6、所述循环肿瘤细胞检测试剂包括所述dsa-pph3分子和polya-tsp-aunps，所述polya-tsp-aunps在端粒酶的作用可增加肿瘤细胞内的负电荷载位；而肿瘤细胞内的线粒体具有高电位差的磷脂双分子层，使用dsa-pph3分子可同时实现对线粒体和被延长polya-tsp-aunps的双靶向，以增强肿瘤细胞和白细胞的荧光差异。因此，dsa-pph3分子作为线粒体荧光探针标记待测样品中的循环肿瘤细胞；所述polya-tsp-aunps识别所述循环肿瘤细胞的端粒酶，并在所述循环肿瘤细胞内特异性延伸，以增强肿瘤细胞和白细胞的负电荷载位，从而被dsa-pph3分子识别，进一步增强了两者的荧光差异。

7、所述polya-tsp-aunps主要由以下方法获得：先根据核苷酸序列如seq.no.1所示的端粒酶特异性识别序列tsp及核苷酸序列如seq.no.2所示的polya序列设计合成核苷酸序列如seq.no.3所示的polya-tsp序列，并配制polya-tsp溶液；再将aunps溶液和所述polya-tsp溶液超声混合，通过利用polya对aunps的吸附作用将aunps吸附至所述polya-tsp上。其中，优选地，所述polya-tsp-aunps合成ph为9.0-9.5，所述polya-tsp溶液的浓度为1μmol/l、体积72-100μl，所述aunps溶液的浓度为3×10-3-4×10-3μmol/l、体积1000-1200μl，所述aunps的粒径为10-15nm。

8、所述循环肿瘤细胞的来源并没有特别限定，可用于检测即可，例如可以来源于肺癌、肝癌、宫颈癌、结肠癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌中一种或两种以上的肿瘤细胞。

9、一种循环肿瘤细胞检测试剂，其包括上述dsa-pph3分子和polya-tsp-aunps。优选地，所述dsa-pph3分子浓度为4.198-33.564μmol/l，所述polya-tsp-aunps的浓度为3.19×10-3μmol/l、体积为100 -140μl。

10、为了有效提高对某些线粒体活性较低的肿瘤细胞的检测特异性和灵敏度，尤其是与白细胞的外观差异度较小，如与白细胞的外观差异小于1.5倍时，所述检测试剂还包括细胞核染料和cd45-apc荧光抗体。其中，所述细胞核染料优选为hoechst 33342。

11、一种循环肿瘤细胞检测试剂盒，其包括上述循环肿瘤细胞检测试剂。其中，所述试剂盒还可以包括储存所述检测试剂的容器。所述试剂盒还可以包括使用所述试剂盒的指导说明，例如产品说明书、使用示意图等。

12、一种循环肿瘤细胞检测系统，包括流式细胞仪和上述循环肿瘤细胞检测试剂或试剂盒。

13、上述检测试剂、试剂盒或检测系统的使用方法包括如下步骤：先对所述polya-tsp-aunps和待测样品中的循环肿瘤细胞进行混合孵育处理，然后加入所述dsa-pph3分子、hoechst 33342和cd45-apc荧光抗体进行混合孵育处理。其中，所述检测试剂的使用方法还包括采用流式细胞术对添加dsa-pph3分子混合孵育后的体系进行检测的步骤。

14、当所述待测样品为血液样品时，所述检测试剂、试剂盒或检测系统的使用方法包括待测样品预处理的步骤；所述预处理包括对血液样品进行离心、cellsearch试剂盒富集处理。

15、具体地，所述检测试剂、试剂盒或检测系统的使用方法包括：

16、1)对待测样品进行预处理，得到循环肿瘤细胞；

17、2)向所述循环肿瘤细胞中加入polya-tsp-aunps进行混合孵育处理，增强肿瘤细胞与白细胞的负电荷差异，得到polya-tsp-aunps扩增体系；

18、3)向所述polya-tsp-aunps扩增体系中加入dsa-pph3分子、hoechst 33342以及cd45-apc荧光抗体混合孵育，得到线粒体和端粒酶双靶向荧光增强体系；

19、4)对所述线粒体和端粒酶双靶向荧光增强体系中的细胞进行重悬和流式细胞术检测。

20、其中，所述待测样品优选为血液或胸腔积液。所述步骤2)的孵育时间为80-140min；所述步骤3)的孵育时间为20-40min。

21、因此，本发明提供的上述检测试剂、试剂盒和检测系统，依据肿瘤细胞中线粒体的代谢异常且膜带负电荷，使用带有正电荷的aie荧光探针dsa-pph3可实现肿瘤细胞与白细胞荧光差值的一次放大；然后根据肿瘤细胞内具有异常活性的端粒酶特性，合成了带有端粒酶信标的polya-tsp-aunps，其被载入细胞后，核酸信标tsp会被延伸从而增加肿瘤细胞内的负电荷含量。此时dsa-pph3荧光探针的使用，可实现肿瘤细胞与白细胞荧光差值的二次放大，因此，基于线粒体和端粒酶活性，可以实现ctcs的高对比度双锚定鉴定，可以显著提升鉴定效率。

22、进一步，本发明提供的上述检测试剂、试剂盒或检测系统中的dsa-pph3和polya-tsp-aunps联合使用，克服了现有的端粒酶和线粒体检测方法中存在的操作繁琐、材料合成难、灵敏度不高等问题，从而使得线粒体检测法和端粒酶检测法联用具有所需材料合成简单便捷，操作时间短、灵敏度高及保持细胞活性等特点。

23、进一步，使用本发明提供的上述检测试剂、试剂盒或检测系统，并结合流式细胞仪可以实现ctcs的高对比度鉴定，而且可保持细胞活性，其内部的dna与rna质量良好。