一种丝状真菌染色处理与荧光直摄的方法

本发明属于真菌检测技术及图像处理领域，更具体涉及一种丝状真菌染色与荧光直摄的方法。

背景技术：

0、技术背景

1、全球每年会产出大量的麦麸、棉籽皮和秸秆等农/林业副产物，预计到2025年全球农业副产物的全年总量将增加到22亿吨。农/林业副产物含有大量的木质纤维素是农畜和微生物生长的营养来源。但限于处理技术与成本等原因，除少量用于动物饲料外，大部分被焚烧后填埋处理，排放的一氧化碳(co)、二氧化碳(co2)和颗粒物(pm10和pm2.5)对环境产生严重危害。

2、近年来，以真菌代谢稻壳、木屑等)组成的菌丝复合材料(mycelium-basedcomposites)引起了建筑领域的关注。菌丝复合材料充分利用农/林业副产物，通过真菌代谢产生的菌丝将农/林业副产物进行粘结与包裹，替代了传统室内建材中使用的化学胶质材料，降低其生产能耗，减少有毒物质(如甲醛)对人体和环境的危害；菌丝复合材料中的原材料廉价(0.5～1.21元/kg)，远低于聚苯乙烯(15～16.4元/kg)和胶合板(3.6～7.9元/kg)等成本；试样内分布的大量孔隙和菌丝中的几丁质使菌丝复合材料在抗冲击、防火、防水和降噪等方面表现出明显优势。

3、对真菌菌丝生长参数的监测与统计是优化菌丝复合材料制备流程与后续试样力学强度研究的重要步骤。由于菌丝是真菌在试样内生长后得到，直径只有1～30μm。目前对真菌菌丝定殖长度的研究多是直观观察，但真菌是顶端生长，这部分多呈透明色，通过肉眼直接观察和测量菌丝定殖长度时容易产生误差。利用荧光染色可以有效的解决这一问题，但已有技术大多是针对真菌细胞进行染色，且多是利用显微镜进行观察。这种方法限制了大批量统计真菌菌丝生长长度与生长覆盖范围的速度。因此，需要开发一种更便捷地真菌菌丝荧光染色技术，以及更便捷的荧光拍摄技术。

技术实现思路

1、为解决上述技术存在的问题，本发明的目的是在于提供了一种丝状真菌染色与荧光直摄的方法，方法易行，操作简便，能方便地对真菌菌丝长度和生长区域的精细化进行统计。利用手持摄像设备进行拍摄并结合图像处理软件后便可对菌丝覆盖范围、生长长度等参数进行快速和精准地统计，摆脱了传统荧光染色利用的电子显微镜带来观察范围的局限性，大大加速了菌丝生长参数的统计速度。

2、为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

3、其构思是：所述发明步骤由真菌染色液和荧光直摄步骤组成。所属真菌染色液包括二乙酸酯、二甲基亚砜和丙酮。所述荧光直摄所需设备包括荧光激发灯源、手持移动摄像设备、截止滤光片。利用该步骤可以对丝状真菌的菌丝(hyphae)和菌丝体(mycelium)进行快速染色；仅利用手持摄像设备进行拍摄并结合图像处理软件后便可对菌丝覆盖范围、生长长度等参数进行快速和精准地统计，摆脱了传统荧光染色利用的电子显微镜带来观察范围的局限性，大大加速了菌丝生长参数的统计速度。一种真菌染色剂包括：二乙酸酯粉末1-20mg、二甲基亚砜1-60ml、丙酮10-500ml。一种荧光直摄步骤所需设备包括：荧光激发灯源(300～500nm)、单反相机拍摄参数为快门1/100-1/10、光圈f/2.5-f/10.5、感光度iso 100-iso400。截止滤光片(300-500nm)。

4、一种丝状真菌染色与荧光直摄的方法(真菌染色技术与荧光直摄优化方法)其步骤是：

5、1、将二乙酸酯(fda)粉末从低温(1.5－2.5℃)箱中取出，在室温(20±2℃)下放置10-20分钟。在避光环境下用天平称取1-20mg二乙酸酯粉末。将粉末缓慢的加入到1-100ml二甲基亚砜中，缓慢震荡使粉末溶解。

6、2、称量10-500ml丙酮，将上述溶液缓慢倒入含有丙酮溶液试剂瓶内。在避光环境缓慢震荡试剂瓶2-10分钟。

7、3、将震荡后的溶液倒入100ml喷瓶中。在避光环境内向真菌喷射1-50ml溶液，并静置5-10分钟。重复该过程2-3次。

8、4、在避光环境下，将真菌样品放置在300-500nm荧光激发灯源环境中。在拍摄镜头前加装300-500nm截止滤光片。调整相机拍摄参数为快门1/100-1/10、光圈f/2.5-f/10.5、感光度iso 100-iso 400后进行拍摄。

9、5、拍摄后利用图像处理软件(imagej)统计菌丝定殖范围和长度等参数。

10、通过上述五个步骤的技术措施，关键的步骤3和步骤4，通过步骤3控制染色液喷射次数与间歇时间，简单便捷地对真菌菌丝进行染色，使菌丝高效地、充分地吸收荧光染色剂，主要解决了真菌菌丝吸收荧光染色剂时间不明确，染色效果不良的问题，方便了后续菌丝激发荧光拍照的进行。步骤4通过调整激发光源，拍摄相机快门、光圈和感光度参数，优化了真菌菌丝荧光成像的效果，解决了成像效果差的问题。与已有的真菌染色方法相比，本发明的技术进步在于：与生物与医疗领域中的菌丝荧光染色步骤相比，试验使用的染色剂种类仅为三种，简化了真菌菌丝的荧光染色材料种类；染色步骤简洁且明晰，降低了测试成本，缩短了试验测试周期。其次，本发明中通过使用手持式摄像设备和图像处理软件(imagej)，可以快速和精确地测量菌丝的覆盖范围、生长长度等参数，克服了传统荧光染色电子显微镜的观察范围限制，极大地提高了菌丝生长参数的测量效率，方便了真菌制品研发中的真菌生长培育的研究。

11、本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

12、(1)费用低廉。本发明中荧光染剂由三种材料组成，且均为常用生化耗材；荧光拍照步骤无需价格昂贵的荧光电子显微镜进行，仅需一定波长的荧光光源、截止滤光片、数码相机和避光环境即可。降低了试验的成本。

13、(2)测试周期短。荧光染色阶段仅需2-3次循环喷射染色液后便可开始荧光激发与荧光拍摄工作，无需专业技术人员操作，减少了人力物力。

14、(3)测试方法简易。通过简单调试荧光光源、滤光片范围与数码相机拍摄参数，即可获得清晰的真菌菌丝荧光激发图片。利用常见开源图片处理软件可对图片进行后处理与信息提取。

15、(4)测试范围广泛。除了能够应用于专业培育真菌菌丝的定殖范围测试外，同样可用于土壤中是否存在丝状真菌于其范围的测量。

技术特征：

1.一种丝状真菌染色与荧光直摄的方法，其特征在于，其步骤是：

2.根据权利要求1所述的一种丝状真菌染色与荧光直摄的方法，其特征在于：所述步骤(a)中的低温为2℃。

3.根据权利要求1所述的一种丝状真菌染色与荧光直摄的方法，其特征在于：所述步骤(c)中的避光环境内向真菌喷射4ml溶液，静置8分钟，重复该过程2次。

技术总结本发明公开了一种丝状真菌染色处理与荧光直摄的方法，步骤是：1、将二乙酸酯粉末从低温箱中取出，在室温下放置。在避光环境下用天平称取二乙酸酯粉末。将粉末的加入到二甲基亚砜中，缓慢震荡使粉末溶解。2、称量丙酮，将上述溶液缓慢倒入含有丙酮溶液试剂瓶内。在避光环境缓慢震荡试剂瓶。3、将震荡后的溶液倒入喷瓶中。在避光环境内向真菌喷射溶液，静置。重复该过程。4、在避光环境下，将真菌样品放置在荧光激发灯源环境中。在拍摄镜头前加装截止滤光片。5、拍摄后利用图像处理软件统计菌丝定殖范围和长度等参数。方法易行，操作简便，能方便地对真菌菌丝长度和生长区域的精细化进行统计。大大加速了菌丝生长参数的统计速度。技术研发人员：苟乐宇,张先伟,王港,高浩东,严蕾,朱华亮受保护的技术使用者：中国科学院武汉岩土力学研究所技术研发日：技术公布日：2024/10/17