薰衣草活性化合物的应用和制备方法

本发明属于医药，涉及薰衣草中24种挥发性天然产物的抗衰老和拟神经生长因子(ngf)活性鉴定，具体涉及薰衣草活性化合物的应用和制备方法。

背景技术：

1、目前全国人口持续减少、老龄化问题日益突出。研究表明，衰老是多种老年性疾病的重要致病因素，如癌症、糖尿病和神经退行性疾病(阿尔茨海默症)等。目前已有实验证明了生物的衰老速度以及寿命的长短是可以进行人为干预的，因此，开发具有抗衰老和治疗神经推行性疾病的药物，达到防治衰老疾病和实现健康长寿的目的，具有重大意义。

2、目前，针对不同的衰老标志物及其生理机制理论，已经开发了一些具有抗衰老作用的物质，比如抗氧化剂白藜芦醇、自噬激活剂雷帕霉素和端粒酶激活剂黄芪根提取物ta-65等。但是，衰老是一项复杂的生理现象，仅针对单一机制的化合物在临床试验过程中出现了种种问题，包括剂量摄入过度扰乱内源性信号通路，药物不良副作用等。这些弊端影响了抗衰药物的进一步开发。目前大多数的抗衰药物都是天然来源，其具有绿色健康、结构新颖、摄入简便等优点易于被大众接受。ad是一种神经退行性疾病，以记忆力和认知功能损害为主要临床病症,严重时会导致生活不能自理。但ad的准确分子机制尚未定论，目前科学上存在基于致病因素的各种理论和假设。市售药物不能从根本上终止病情恶化、逆转病情，治愈和康复更无从谈起。因此，寻找强效可逆转其病情的新类型抗ad药物已经刻不容缓。研究表明，神经生长因子(ngf)是维持机体神经元的生长和分化最有效的成分，同时对于神经元损伤的修复和再生效果显著。ngf能增强中枢胆碱能神经元的营养作用，也可以减少aβ的产生，具有抗ad的潜力。然而，由于ngf分子量大和极性强等原因，不能通过血脑屏障，并且难以大规模制备等诸多因素，局限了它的实际临床应用。因此，从天然产物中开发具有多机制抗衰效果、拟神经生长因子活性的小分子化合物，具有较高的研究价值和广泛的应用前景。

技术实现思路

1、针对上述背景技术中的缺陷，本发明提供薰衣草活性化合物的应用和制备方法。薰衣草中的24种单一天然产物(乙酸芳樟酯、β-环柠檬醛、芳樟醇、β-香茅醇、香叶醇、乙酸香叶酯、甲酸香茅酯、柠檬醛、薄荷醇、紫苏醇、紫苏醛、乙酸橙花酯、罗勒烯、氧化石竹烯、反式石竹烯、α-石竹烯、樟脑、桉油精、桃金娘烯醇、4-松油醇、l-香芹醇、丁香酚、枯茗醛和3-辛酮)和12种天然产物组合具有拟ngf活性；24种单一天然产物和6种天然产物组合具有抗衰老活性。本发明还提供了从薰衣草中提取4种挥发性天然产物的制备方法，探究了1种挥发性天然产物β-环柠檬醛的延长细胞寿命和促进神经突起伸长的作用机制。

2、本发明的第一个目的是提供从薰衣草精油中提取挥发性化合物的方法，通过以下技术方案实现：

3、(1)取3g薰衣草精油(购自integria healthcare有限公司)，通过silica柱层析分离。使用的溶剂系统为正己烷/二氯甲烷(100/0、90/10，80/20，70/30，60/40，0/100)。然后通过tlc分析将相近比移值(rf值)的洗脱液合并，合并得到8个馏分样品i-a-1～i-a-8。

4、(2)用k6001酵母复制性寿命生物活性系统和pc12细胞拟ngf活性筛选生物活性系统测定8个馏分样品的生物活性。根据生物活性结果，确定i-a-2、i-a-4、i-a-5和i-a-6为目标馏分。

5、(3)取10mg i-a-2，以乙腈-水溶剂系统做洗脱剂，利用反相hplc(odsφ20×250mm，乙腈：水＝70:30、60min，8ml/min，210nm)对目标馏分进行分离纯化，得到化合物1(3.6mg,tr＝27.3min)；

6、取10mg i-a-4，以甲醇-水溶剂系统做洗脱剂，利用反相hplc(5c18-ms-iiφ10×250mm，甲醇:水＝40:60-100:0、80min，3ml/min，210nm)对目标馏分进行分离纯化，得到化合物2(2.8mg,tr＝49.7min)；

7、取10mg i-a-5，以乙腈-水溶剂系统做洗脱剂，利用反相hplc(odsφ20×250mm，乙腈：水＝50:50、60min，8ml/min，210nm)将对目标馏分进行分离纯化，得到化合物3(3.1mg,tr＝36.1min)；

8、取10mg i-a-6，以甲醇-水溶剂系统做洗脱剂，利用反相hplc(5c18-ms-iiφ10×250mm，甲醇:水＝70:30，60min，3ml/min，210nm)对目标馏分进行分离纯化，得到化合物4(2.4mg,tr＝30.9min)；

9、(4)将化合物1、2、3、4的有机相-水洗脱液，分别加入等体积的正戊烷萃取3次，向正戊烷层样品中加入无水硫酸钠后过滤，经减压蒸馏(35℃，0.1mpa)浓缩后获得目标化合物。将1h nmr和hr esi-tof-ms数据与文献进行比较确定其结构。

10、本发明的第二个目的是提供24种具有抗衰老活性的薰衣草来源天然产物，其鉴定过程如下：通过对分离得到的4种化合物构效进行分析并对薰衣草中其它挥发性化合物进行结构比较，推测其它化合物具有抗衰老活性，同时对另外20种化合物进行活性筛选。根据k6001酵母复制性寿命结果确定，24种挥发性化合物均具有抗衰老活性，并且在不同剂量下活性表现有所不同。

11、本发明的第三个目的是提供6种提升抗衰老活性的组合。对低浓度下无活性或低活性的化合物进行组合后，组合物具有显著的抗衰老活性，6种具有显著活性的天然产物组合汇总表格如下：

12、表1 6种抗衰老天然产物组合及其剂量与活性(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)

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14、本发明的第四个目的是提供萜类化合物β-环柠檬醛预防和/或治疗抗衰老疾病药物和保健品中的作用机制。经查阅文献，化合物β-环柠檬醛的抗衰老活性及其作用机制未见报道，具有新颖性，因此对其抗衰老的作用机制进行进一步研究。我们发现β-环柠檬醛通过抗氧化应激、增强自噬和激活端粒酶的作用机制，可以显著延长酵母及哺乳动物细胞的寿命，未来有希望应用于制备抗衰老疾病药物。

15、(1)在抗衰老活性测定实验中，β-环柠檬醛可以延长酵母的复制性寿命和时序性寿命，并且能够抑制依托泊苷诱导的pc12细胞和3t3细胞衰老；

16、(2)在抗氧化应激实验中，β-环柠檬醛可以显著提高酵母在氧化应激环境下的存活率，并且降低ros与mda水平，调节t-sod，cuzn-sod和cat的酶促活性；

17、(3)在自噬激活实验中，β-环柠檬醛不会延长自噬相关蛋白atg2和atg32的突变株酵母寿命并且可以提高酵母体内自噬的发生。

18、本发明的第五个目的是提供具有拟ngf活性的薰衣草来源24种单一天然产物，化合物其鉴定过程如下：通过对分离得到的4种化合物构效进行分析并对薰衣草中其它挥发性化合物进行结构比较，推测其它化合物具有拟ngf活性，对20种化合物进行活性筛选。根据pc12细胞拟ngf活性筛选系统结果确定，化合物1-24都能够促进神经突起伸长，具有拟ngf活性。

19、本发明的第六个目的是提供具有拟ngf活性的薰衣草来源的12种天然产物组合。化合对低剂量下无活性或低活性的单个化合物进行组合，实验发现，有12种组合显示出显著的拟ngf活性，不仅与control组相比具有显著性差异(p＜0.001)，且组合的神经突起分化率大于单个化合物神经突起分化率的相加值；12种组合的各组分组合浓度及比例如表2。

20、表2 12种拟ngf天然产物组合及其剂量

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22、本发明的第七个目的是提供萜类化合物β-环柠檬醛预防和/或治疗神经退行性疾病药物和保健品中的作用机制。经查阅文献，化合物β-环柠檬醛的拟ngf活性及其作用机制未见报道，具有新颖性，因此对其拟ngf的作用机制进行进一步研究。我们发现β-环柠檬醛通过靶向igf-1r和gr并激活pi3k/akt和plc/pkc信号通路发挥促神经突起伸长作用，未来有希望应用于治疗神经退行性疾病药物。

23、(1)在拟ngf活性测定实验中，以上单一化合物以及部分它们的混合物均能显著促进pc12细胞神经突起伸长。其中β-环柠檬醛能显著促进pc12细胞神经突起伸长，证明其具有拟ngf活性，且与低剂量ngf共同作用后，表现出显著的ngf enhancer活性。

24、(2)化合物β-环柠檬醛通过靶向igf-1r和gr从而激活pi3k/akt和plc/pkc信号通路发挥拟ngf活性并促神经突起伸长，从而改善阿尔茨海默症等神经退行性疾病的症状。

25、本发明的第八个目的是提供薰衣草活性化合物及组合在制备预防和/或治疗抗衰老和神经保护药物和保健品中的应用。所述药物和保健品由薰衣草活性化合物与药学上可接受的载体组成。这里所述的药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，例如：

26、(1)稀释剂、赋形剂等；

27、(2)填充剂如淀粉、蔗糖、微晶纤维素等；

28、(3)粘合剂如淀粉浆、羟丙纤维素、明胶、聚乙二醇等；

29、(4)湿润剂如硬脂酸镁、微粉硅胶、聚乙二醇类等；

30、(5)吸收促进剂聚山梨脂、卵磷脂等；

31、(6)表面活性剂伯洛沙姆、脂肪酸山梨坦、聚山梨脂等；

32、(7)其它辅剂如香味剂、甜味剂等。

33、给药的剂型可以是片剂，丸剂，粉剂，分散片，小药囊剂，酏剂，混悬剂，乳剂，溶液剂，糖浆剂，气雾剂，软胶囊，硬胶囊，无菌注射液，搽剂或栓剂。可制成常规，速释，缓释或延迟释放。本发明的β-环柠檬醛可通过各种途径给予，包括口服，肌肉注射，皮下注射，腹腔注射，静注等。

34、本发明的第九个目的是提供薰衣草活性化合物及组合在制备预防和/或治疗老年性疾病(特别是神经退行性疾病)的食品和日用品及化妆品中的应用。所述食品和日用品由薰衣草活性化合物与日常食品和日用品的结合。这里所述的食品包括面包、糖果、零食等。日用品包括床垫和枕头等家具，香炉和蒸发器熏香，复方按摩油、洗漱产品、面霜和润肤乳的产品。

35、本发明的优点是：

36、(1)采用正戊烷进行溶剂分配，用无水硫酸钠除去水分，在35℃、0.1mpa的条件下进行减压蒸馏。甲醇/乙腈-水-挥发性化合物组成的混合物无法进行传统的减压蒸馏，会导致化合物全部挥发无法保存。正戊烷具有极性低，沸点低，对低极性的挥发性化合物有较强的溶解性等特征，通过正戊烷萃取再进行减压蒸馏可以显著减少目标产物损耗并提升纯度。

37、(2)本发明采用的原材料是来源易得、资源丰富的薰衣草精油，其广泛应用于各种生活场景中。本发明发现的具有抗衰老和拟ngf活性的天然产物，能够挥发出令人愉悦的香气，可以添加至食品、衣物、日用品和化妆品中，使得本发明具有实用性。

38、(3)本发明筛选出了薰衣草精油中具有抗衰老活性和具有拟ngf活性的24种挥发性化合物，6种具有显著抗衰老活性和12种具有显著拟ngf活性的化合物组合，提升了应用价值。

39、(4)本发明探究了β-环柠檬醛的抗衰老活性的作用机制，此化合物未见相关抗衰报道，具有新颖性。我们发现β-环柠檬醛通过抗氧化应激、增强自噬和激活端粒酶的作用机制，可以显著延长酵母及哺乳动物细胞的寿命，未来有希望应用于制备抗衰老药物。

40、(5)本发明报道了β-环柠檬醛的拟ngf和促神经伸长活性，此化合物未见相关抗ad和拟ngf活性报道，具有新颖性。并且研究了其发挥拟ngf活性的作用机制与靶点，研究发现β-环柠檬醛通过靶向igf-1r和gr激活pi3k/akt和plc/pkc信号通路发挥拟ngf作用，未来有希望应用于制备神经退行性疾病药物。