一种饲料中霉酚酸的分子印迹电化学传感检测方法及电化学传感器

本发明涉及饲料安全检测，特别是涉及一种饲料中霉酚酸的分子印迹电化学传感检测方法及电化学传感器。

背景技术：

1、霉酚酸(mycophenolic acid,mpa)是一种由娄地青霉菌产生的有害次级代谢物，常在谷物青贮饲料中检测出，对生产动物有潜在的健康威胁。研究发现，mpa对反刍动物的瘤胃微生物活性有明显的抑制作用，严重影响了反刍动物的生产效率，并且，mpa对青贮环境中的有益菌正常生长有抑制作用，降低了青贮饲料的质量。此外，mpa也被用作实体器官移植，是全球使用最多的免疫抑制药物之一，作用机制在于mpa是真核肌苷单磷酸脱氢酶的非竞争性抑制剂，通过抑制嘌呤核苷酸从头合成途径的关键限速酶，使鸟嘌呤核苷酸的合成减少，因而能特异性阻断t淋巴细胞和b淋巴细胞增殖，孕妇暴露在mpa环境中有导致胎儿畸形的风险。鉴于mpa的高危害性，建立一种快速有效的检测方法极为重要。

2、传统的检测mpa的方法主要有高效液相色谱法、色谱串联质谱法、酶联免疫吸附试验法等。这些传统的检测方法具有成熟的技术，准确的检测结果等优点，但同时存在检测成本高、方法操作复杂、耗时长等不足之处。近年来，电化学传感器因其响应快速，操作简单且成本低等优点得到越来越多的应用，而霉酚酸也具备电催化活性，但是，普通的电化学传感器存在选择性差、抗干扰能力弱等问题。目前，虽已有报道基于机器学习模拟构建分子印迹传感检测霉酚酸的方法，但依然缺乏制备实际的分子印迹传感器件并用于饲料中霉酚酸的检测方法。产生缺乏构建实际传感器的主要原因在于难以找到合适的制备分子印迹传感器的功能单体。

3、因此，寻找一种检测快速，灵敏度高、成本低、特异性高和准确度高的检测方法是本领域亟需解决的问题之一。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种饲料中霉酚酸的分子印迹电化学传感检测方法及电化学传感器。

2、本发明的电化学传感器是一种基于bp/bi@c纳米复合材料分子印迹电化学传感器，能够对mpa进行精准检测。通过超声波辅助液相剥离法制备了bp，采用简单退火法制备了bi@c，最后通过简单的自组装方法合成了bp/bi@c纳米复合材料。此外，采用沉淀聚合法合成了mips颗粒，并滴涂制备了mip/bp/bi@c/gce。所构建的mip/bp/bi@c/gce具有优异的mpa传感性能和适用性，能够为mpa的痕量分析提供更为准确的检测结果。

3、具体而言，本技术提供了如下技术方案：

4、一种检测饲料中霉酚酸的分子印迹电化学传感器的制备方法，包括以下步骤：

5、(1)基底工作电极抛光处理

6、1.1)打磨工作电极：首先采用氧化铝抛光粉将工作电极打磨成镜面，再将打磨成镜面的工作电极分别在蒸馏水、无水乙醇、蒸馏水中依次超声清洗，以彻底去除吸附在工作电极表面上的氧化铝粉末和其它污染物，随后在冷空气中吹干；

7、1.2)判断电极打磨合格：将步骤1.1中吹干的工作电极、参比电极、对电极三电极体系置于电化学探针溶液中，利用循环伏安法扫描，并与理论标准谱对照两峰之间的电位差，在规定范围内即电极打磨合格；

8、(2)基于mip/bp/bi@c修饰电极的制备

9、2.1)将bp纳米片粉末和bi@c粉末混合后，经n，n-二甲基酰胺和水分散并超声处理后，得到所述bp/bi@c纳米复合材料悬浊液；

10、2.2)将mip粉末经0.2％壳聚糖(cs，溶于2％乙酸)溶液分散并超声处理后，得到所述mip悬浊液；

11、2.3)将步骤2.1制得的bp/bi@c纳米复合材料悬浊液滴涂在工作电极表面并在红外条件下干燥，得到bp/bi@c修饰电极；将步骤2.2制得的mip悬浊液滴涂在bp/bi@c修饰电极表面并在红外条件下干燥，得到mip/bp/bi@c修饰电极，即所述分子印迹电化学传感器。

12、进一步地，所述步骤1.1中，所述氧化铝抛光粉的粒径为0.04～0.06μm；所述工作电极为玻碳电极、石墨电极、金电极或铂电极中的任意一种。

13、进一步地，所述步骤1.2中，所述参比电极为饱和甘汞电极或银/氯化银电极；所述对电极为铂电极、金电极或钨电极；所述电化学探针溶液为含有0.1mol/l kcl的5mmol/l[fe(cn)6]3-/4-溶液或含有0.1mol/l kcl的5mmol/l[ru(nh3)6]2+/3+溶液；所述规定范围内是指100mv以下。

14、进一步地，所述步骤2.1中，所述bp纳米片粉末采用超声波辅助液相剥离黑磷块制备，具体制备过程为：将5.0mg黑磷块添加到10.0ml进行脱氧处理后的饱和naoh-nmp溶液中；然后在持续性的注入高纯氮气保护下，超声波处理6.0h；产生的棕色悬浮液在1000rpm下离心10min，去除沉淀以除去未剥离的黑磷块；随后，将取出的悬浮液再次以9000rpm的转速离心10min，去除上清液后冷冻干燥24小时，以获得剥离的bp纳米片粉末。

15、进一步地，所述步骤2.1中，所述bi@c粉末采用简单退火法进行制备，具体制备过程为：将2.0g柠檬酸铋加入到刚玉舟中并置于管式炉内，加热前先使用n2填充30min，然后以每分钟10℃的升温速率升至900℃保持2.0h，期间保持n2环境，自然冷却至室温后取出，得到bi@c粉末，存于干燥环境下。

16、进一步地，所述步骤2.2中，所述mip粉末采用沉淀聚合法进行制备，具体制备过程为：将2.5mmol mpa、3.0mmolα-甲基丙烯酸(maa)溶解于30.0ml四氢呋喃(thf)中，在烧瓶中搅拌30min，然后加入2.0mmol 4-乙烯基吡啶(4-vp)，再搅拌30min，然后加入4.0mmol乙二醇二甲基丙烯酸酯(egdma)、20.0mg偶氮二异丁腈(aibn)，超声处理60min，n2脱氧，60℃加热下搅拌12.0h。将上述制备的材料以体积比为8:2的甲醇:乙酸洗脱液洗脱45min，得到mips颗粒；最终产物用蒸馏水洗涤离心(7000rmp)数次，60℃真空过夜干燥，获得mip粉末。

17、本发明上述方法制备的分子印迹电化学传感器中的分子印迹颗粒能够特异性结合mpa，从而有利于mpa的富集并且减少其他物质的干扰。待测液的mpa浓度越高，被分子印迹膜结合的mpa就会越多，在电极上参与氧化反应的mpa也就越多，形成的氧化峰电流就会越大，进而实现了mpa的快速、准确、特异性高的检测。

18、基于本发明制备的上述分子印迹电化学传感器，对霉酚酸的电化学传感检测方法，包括以下步骤：

19、将待测样品的提取液加入至pbs电解液中，采用上述的分子印迹电化学传感器作为工作电极，与参比电极、对电极一同浸没在pbs电解液中，构建三电极体系，采用方波伏安法测定氧化峰电流值，最后根据霉酚酸检测标准工作曲线，得到待测样品中霉酚酸的浓度；

20、其中，所述霉酚酸检测标准工作曲线的构建方法为：

21、以0.1mol/l pbs溶液作为电解液，采用述的分子印迹电化学传感器作为工作电极，与参比电极、对电极一同浸没于电解液中，搭建三电极体系，采用方波伏安法对不同浓度霉酚酸的待测液进行检测，获得不同浓度霉酚酸的待测液的氧化峰电流值，然后以霉酚酸的浓度为自变量，以不同浓度霉酚酸的待测液对应的氧化峰电流值为因变量，得到所述霉酚酸检测标准工作曲线。

22、其中，方波伏安法的参数条件包括：电位扫描范围为0.2v-1v，电位增量为0.004v，振幅为0.025v，频率为15hz。所述参比电极为饱和甘汞电极或银/氯化银电极，所述对电极为铂电极、金电极或钨电极。

23、与现有技术相比，本发明饲料中霉酚酸的分子印迹电化学传感检测方法及电化学传感器至少具有以下有益效果：

24、(1)本发明电化学传感器的制备方法首次将bp纳米片与bi@c纳米材料复合，使其能够大大增加mpa的电催化活性，从而为mpa的痕量分析提供灵敏度更高的检测结果。

25、(2)本发明电化学传感器的制备方法采用双功能单体制备了霉酚酸分子印迹膜，是首次以沉淀聚合法合成了以mpa为模板的分子印迹聚合物，检测时有利于mpa的富集并且减少其他物质的干扰，大大提高了电化学传感器在检测mpa时的选择性和抗干扰能力。

26、(3)本发明制备方法简单且成本低，检测方法操作便捷，可用于玉米青贮和小麦青贮等实际样品中mpa的快速定量检测。

27、下面结合附图对本发明饲料中霉酚酸的分子印迹电化学传感检测方法及电化学传感器作进一步说明。