肺动脉高压相关的PLEKHH2基因突变及其应用

本发明属于生物医药，具体地，本发明涉及肺动脉高压相关的plekhh2基因突变及其应用。背景技术：：：1、肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension，pah)是一类以肺动脉压力升高、肺血管阻力进行性增大为主要特征的恶性肺血管疾病，往往导致严重右心功能衰竭甚至死亡(中华医学会呼吸病学分会肺栓塞与肺血管病学组等,中国肺动脉高压诊断与治疗指南(2021版).中华医学杂志,2021,101(1):11-51)。特发性肺动脉高压(idiopathicpulmonary arterial hypertension，ipah)和遗传性肺动脉高压(heritable pulmonaryarterial hypertension，hpah)是最主要的肺动脉高压类型之一，在第一大类肺动脉高压中占比37％-49％(zhi-cheng jing等,(2007)chest,132:373-379；raymond l benza等,(2012)chest,142(2):448-456)。ipah/hpah在儿童到成人各年龄段均可发病(hassoun pm等,(2021)n engl j med,385(25):2361-2376)，中国患者发病较早，平均年龄35岁(ruilinquan等,(2022)respirology,27(7):517-528)。ipah/hpah病理机制不清，患者预后恶劣，已经成为我国重大疾病负担。2018年国家卫生健康委员会等五部委将ipah/hpah列入《中国第一批罕见病目录》，明确其为国家主要罕见病，呼吁加强临床与基础研究(国家卫生健康委员会.关于公布第一批罕见病目录的通知(国卫医发(2018)10号))。2、ipah/hpah是单基因常染色体显性遗传病，具有明显的家族遗传性和聚集性。1954年，dr.dresdale报道了全球首个遗传性肺动脉高压家系。这例家系中的先证者、先证者妹妹和侄子均患有肺动脉高压，提示遗传在肺动脉高压发病中起重要作用(dresdale dt等,(1954)bull n y acad med,30(3):195-207)。1997年，哥伦比亚大学morse j.h.团队利用微卫星标志物技术将家族性肺动脉高压的致病基因定位于2号染色体长臂31-32区间(2q31-33)(morse jh等,(1997)circulation,95(12):2603-2606)。2000年，国际肺高血压联盟(international pph consortium)对8个肺动脉高压家系先证者的2q31-33区间进行精细测序，发现7个先证者均携带bmpr2突变，并且基因突变在各家系内均与疾病表型共分离，成功克隆出第一个肺动脉高压致病基因bmpr2(lane kb等,(2000)nat genet,26(1):81-84)。科学家将家系中发现的bmpr2基因在散发的ipah患者中验证，发现15-20％ ipah患者也存在bmpr2突变，进而确认了bmpr2基因突变可能是hpah与ipah共有的发病机制(girerd b等,(2010)am j respir crit care med,81(8):851-861；liu d等,(2012)eurrespir j,39(3):597-603；wang h等,(2010)clinical genetics,77(2):189-192)。2010年后，随着全基因组测序和全外显子组测序技术的不断成熟，科学家采用上述“家系中发现--散发患者中验证”的研究策略发现了更多的致病基因，包括alk1、eng、cav1和kcnk3等，逐步揭开了肺动脉高压的遗传病因(austin e d等,(2012)circulation cardiovasculargenetics,5(3):336-343；harrison r e等,(2003)j med genet,40(12):865-871；ma l等,(2013)n engl j med,369(4):351-361)。3、随着肺动脉高压致病基因的明确，基于基因突变的遗传检测开始应用到临床。遗传检测具有重要的临床意义：一方面可以明确患者病因，协助疾病的诊断、治疗和危险分层；另一方面，通过识别携带致病性基因突变的患者家属，可以在无任何临床症状前对其进行风险提示和早期预警，并指导家庭生育。2018年与2021年发布两版最新的《中国肺动脉高压诊断和治疗指南》均高度重视遗传检测在肺动脉高压诊治中的重要作用，明确推荐肺动脉高压患者进行遗传检测和咨询(中华医学会心血管病学分会肺血管病学组,中华心血管病杂志编辑委员会.中国肺高血压诊断和治疗指南2018[j].中华心血管病杂志,2018,46(12):933-964；中华医学会呼吸病学分会肺栓塞与肺血管病学组,中国医师协会呼吸医师分会肺栓塞与肺血管病工作委员会,全国肺栓塞与肺血管病防治协作组,等.中国肺动脉高压诊断与治疗指南(2021版)[j].中华医学杂志,2021,101(1):11-51.)。4、由此可见，发现肺动脉高压关键致病基因对于明确患者病因、理解疾病机制至关重要，也是研发对因治疗方式的前提和基石。截至2022年12月，全球共发现21个肺动脉高压遗传相关基因(southgate l等,(2020)nat rev cardiol,17(2):85-95)，这些基因总体上可以解释50-70％ hpah以及20-40％ ipah患者病因(christina a eichstaedt等,(2023)eur respir j,61(2):2201471)。目前尚有超过30％的haph以及超过60％的ipah患者尚未明确遗传病因。探寻更多的肺动脉高压遗传相关基因，对于我们认识ipah/hpah疾病本质、研发创新治疗手段至关重要。技术实现思路1、有鉴于此，本发明的目的在于提供肺动脉高压相关的plekhh2基因突变及其应用。2、为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：3、本发明的第一方面提供了一种用于诊断和/或辅助诊断肺动脉高压的生物标志物。4、进一步，所述生物标志物包括突变型plekhh2蛋白、突变型plekhh2基因；5、所述突变型plekhh2蛋白为具有如下突变位点中的任意一种或多种的plekhh2蛋白：p.i1245t、p.s658f、p.p542s、p.a609t、p.y735c、p.r797x、p.t1240s；6、所述突变型plekhh2基因为具有如下突变位点中的任意一种或多种的plekhh2基因：c.3734t>c、c.1973c>t、c.1624c>t、c.1825g>a、c.2204a>g、c.2389c>t、c.3718a>t。7、进一步，所述突变型plekhh2蛋白是指相对于野生型的plekhh2蛋白具有如下突变位点中的任意一种或多种：p.i1245t、p.s658f、p.p542s、p.a609t、p.y735c、p.r797x、p.t1240s，其中，所述野生型的plekhh2蛋白为野生型的plekhh2基因对应的蛋白质，所述野生型的plekhh2基因在ncbi中的gene id为130271，全长转录氨基酸序列为np_742066.2。8、进一步，所述突变型plekhh2基因是指相对于野生型的plekhh2基因具有如下突变位点中的任意一种或多种：c.3734t>c、c.1973c>t、c.1624c>t、c.1825g>a、c.2204a>g、c.2389c>t、c.3718a>t，所述野生型的plekhh2基因在ncbi中的gene id为130271，成熟mrna转录本序列编号为nm_172069.4。9、本发明的第二方面提供了检测本发明第一方面所述的生物标志物的试剂在制备用于诊断和/或辅助诊断肺动脉高压的产品中的应用。10、进一步，所述试剂包括特异性识别所述突变型plekhh2蛋白的检测试剂和/或针对所述突变型plekhh2基因的检测试剂。11、进一步，特异性识别所述突变型plekhh2蛋白的检测试剂包括特异性结合突变型plekhh2蛋白的抗体、抗体片段和/或亲和性蛋白。12、进一步，针对所述突变型plekhh2基因的检测试剂包括特异性扩增突变型plekhh2基因的引物和/或特异性识别突变型plekhh2基因的探针。13、进一步，所述试剂还包括pcr扩增反应中的常规试剂、dna提取过程中使用的试剂和/或dna测序过程中使用的试剂。14、进一步，所述产品通过检测样本中所述突变型plekhh2蛋白和/或突变型plekhh2基因来诊断和/或辅助诊断受试者个体是否患有肺动脉高压或患肺动脉高压的风险。15、在一些实施方案中，可采用本领域技术人员已知的某些方法来检测所述基因突变，所述方法包括但不限于：dna测序；引物延伸测定法，包括细胞突变特异性核苷酸掺入测定法和细胞突变特异性引物延伸测定法，包括细胞突变特异性pcr、细胞突变特异性连接链式反应(lcr)；突变特异性寡核苷酸杂交测定法，包括寡核苷酸连接测定法；切割保护测定法，其中使用免受切割剂作用的保护来检测核酸双链体中的错配碱基；对muts蛋白结合的分析；比较变异型和野生型核酸分子迁移率的电泳分析；变性梯度凝胶电泳；对rna酶在错配碱基对处切割的分析；分析对异源双链dna的化学或酶促切割；质谱术，包括maldi-tof-ms；遗传比特分析；5’核酸酶测定法，包括taqmantm。16、在一些实施方案中，可采用本领域技术人员已知的某些方法来检测所述蛋白突变，所述方法包括蛋白免疫技术，所述蛋白免疫技术是指包括放射免疫测定、直接、间接或对比酶联免疫吸附测定、酶免疫测定、荧光免疫测定、蛋白质印迹法、免疫沉淀法、基于任何颗粒的免疫测定(例如：使用金颗粒、银颗粒或乳胶颗粒、磁性颗粒或量子点)对目标物进行检测的一类方法的统称，可在微量滴定板或条的形式中实施蛋白免疫法。17、本发明可以利用本领域内已知的任何方法对突变型基因及其对应的突变型蛋白进行检测。本领域技术人员应当理解，检测基因或蛋白的手段不是本发明的重要方面。本发明中所述的突变型基因或突变型蛋白可使用本领域普通技术人员已知的多种检测技术进行检测，这些技术包括但不限于：taqman法、质谱法、dna微阵列法、测序法、微测序、杂交、限制性片段分析、寡核苷酸连接检测、等位基因特异性pcr-hrm或联合应用上述方法。18、在一些实施方案中，所述产品包括试剂盒、芯片或试纸条。19、在一些实施方案中，所述试剂盒还可以包括基因组dna抽提试剂、pcr反应体系试剂、dhplc相关试剂或蛋白质抽提试剂。在优选的实施方案中，所述pcr反应体系试剂包括dntp、mgcl2、taq dna聚合酶、pcr反应缓冲液、去离子水。在优选的实施方案中，所述试剂盒还包括酶切常规组件，所述酶切常规组件包括反应缓冲液、去离子水。20、在一些实施方案中，所述试剂盒中包括适当的容器，所述容器通常至少包括一种小瓶、试管、长颈瓶、宝特瓶、针筒或其它容器，其中可放置一种组分，并且优选地，可进行适当地等分。在试剂盒中存在多于一种的组分时，试剂盒中通常也将包含第二、第三或其它附加的容器，其中分离地放置附加的组分。然而，不同组合的组分可被包含在一个小瓶中。本发明的试剂盒通常也将包括一种用于容纳反应物的容器，密封以用于商业销售。这种容器可包括注模或吹模的塑料容器，其中可保留所需的小瓶。21、在一些实施方案中，所述芯片包括：固相载体、以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针特异性地对应于所述plekhh2基因突变位点所在的序列；优选地，所述固相载体可采用基因芯片领域的各种常用材料，例如包括但不限于塑料制品、微颗粒、膜载体等。所述塑料制品可通过非共价或物理吸附机制与抗体或蛋白抗原相结合，最常用的塑料制品为聚苯乙烯制成的小试管、小珠和微量反应板；所述微颗粒是由高分子单体聚合成的微球或颗粒，其直径多为微米，由于带有能与蛋白质结合的功能团，易与抗体(抗原)形成化学偶联，结合容量大；所述膜载体包括硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜及尼龙膜等微孔滤膜。22、在一些实施方案中，所述寡核苷酸探针为针对本发明所述plekhh2基因突变位点的寡核苷酸探针，可以是dna、rna、dna-rna嵌合体、pna或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合即可。23、本发明的第三方面提供了一种用于诊断和/或辅助诊断肺动脉高压的试剂盒。24、进一步，所述试剂盒包括如下组分：25、(1)有效量的用于检测本发明第一方面所述生物标志物的试剂；26、(2)选自下组的一种或多种物质：容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂和/或溶剂；27、优选地，所述试剂包括特异性识别所述突变型plekhh2蛋白的检测试剂和/或针对所述突变型plekhh2基因的检测试剂；28、更优选地，特异性识别所述突变型plekhh2蛋白的检测试剂包括特异性结合突变型plekhh2蛋白的抗体、抗体片段和/或亲和性蛋白；29、更优选地，针对所述突变型plekhh2基因的检测试剂包括特异性扩增突变型plekhh2基因的引物和/或特异性识别突变型plekhh2基因的探针。30、在一些实施方案中，所述试剂盒包括qpcr试剂盒、免疫印迹检测试剂盒、免疫层析检测试剂盒、流式细胞分析试剂盒、免疫组化检测试剂盒、elisa试剂盒、电化学发光检测试剂盒。31、在一些实施方案中，本发明中所述的试剂盒中包括的引物可以通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员熟知的方法参考已知信息来适当地设计后采用化学合成的方式来制备。本发明中所述的试剂盒中的抗体，可以使用任何结构、尺寸、免疫球蛋白类别、起源等的抗体或其片段，只要它结合靶蛋白质即可。本发明的试剂盒中包括的抗体或其片段可以是单克隆的或多克隆的。抗体片段指保留抗体对抗原的结合活性的抗体一部分或含有抗体一部分的肽。抗体片段可以包括f(ab′)2、fab′、fab、单链fv(scfv)、二硫化物键合的fv(dsfv)或其聚合物、二聚化v区(双抗体)、或含有cdr的肽。32、在一些实施方案中，抗体可以通过本领域技术人员公知的方法来获得。例如，制备保留整个或部分靶蛋白质的多肽或整合编码它们的多核苷酸的哺乳动物细胞表达载体作为抗原。使用抗原免疫动物后，从经过免疫的动物获得免疫细胞并融合癌细胞以获得杂交瘤。然后从杂交瘤培养物收集抗体。最后可以通过使用被用作抗原的标志物蛋白或其部分对获得的抗体实施抗原特异性纯化来获得针对标志物蛋白的单克隆抗体。33、本发明的第四方面提供了一种筛选用于治疗和/或预防肺动脉高压的药物的方法。34、进一步，所述方法包括如下步骤：35、(1)在施用候选药物的条件下饲养能够表达本发明第一方面中所述的突变型plekhh2蛋白和/或突变型plekhh2基因的动物模型；36、(2)在不施用候选药物的条件下饲养能够表达本发明第一方面中所述的突变型plekhh2蛋白和/或突变型plekhh2基因的动物模型；37、(3)确定所述动物模型在施用和不施用所述候选药物的条件下的肺动脉压力、肺血管阻力、动物死亡率的变化；38、其中，若施用所述候选药物的动物模型的肺动脉压力、肺血管阻力、动物死亡率低于不施用所述候选药物的动物模型，则所述候选药物为用于治疗和/或预防肺动脉高压的药物。39、此外，本发明还提供了一种诊断和/或辅助诊断肺动脉高压的系统。40、进一步，所述系统包括如下装置：41、(1)核酸/蛋白提取装置，用于从所述生物样品中提取核酸/蛋白样本；42、(2)核酸/蛋白序列确定装置，与所述核酸/蛋白提取装置连接，用于对所述核酸/蛋白样本进行分析，确定所述核酸/蛋白样本的核酸/蛋白序列；43、(3)结果判断装置，与所述核酸/蛋白序列确定装置相连，基于所述核酸/蛋白样本的核酸/蛋白序列与野生型plekhh2基因/蛋白序列相比较，判断生物样品中是否存在本发明第一方面中所述的突变型plekhh2蛋白/突变型plekhh2基因，进而判断所述受试者是否为肺动脉高压患者或患肺动脉高压的风险。44、本发明的第五方面提供了如下任一方面的应用：45、(1)本发明第一方面所述的生物标志物在肺动脉高压诊断、辅助诊断、风险预测和/或孕前预警中的应用；46、(2)本发明第三方面所述的试剂盒在肺动脉高压诊断、辅助诊断、风险预测和/或孕前预警中的应用。47、为了进一步解释本发明，对本发明中涉及到的专业术语进行如下解释：48、术语“样本”，是指来源于受试者任何合适部分的任何样品。作为非限制性的实施方案，样本可以来源于纯组织或器官或细胞类型。在本发明的其他实施方案中，样本可以来源于体液，例如来源于唾液、脑脊液、血液、血清、痰、黏膜刮除物、组织活检、泪分泌物、精液和汗水等。特别优选采用血液样品，其包含含有dna的细胞，例如非成熟的红细胞、红细胞前体细胞、白细胞等。在本发明的上下文中使用的样品应当优选以临床可接受的方式采集，更优选以保留核酸或蛋白的方式采集。在本发明的检测步骤中，最终作为检测对象的是核酸(优选dna)或蛋白。49、术语“扩增”，是指生成参照核酸序列或其互补物的一个或多个拷贝的过程。扩增可以是线性或指数性的(例如聚合酶链式反应(pcr))。“拷贝”不必然表示相对于模板序列的完全序列互补性或同一性。例如，拷贝可以包含核苷酸类似物诸如脱氧肌苷、有意的序列改变(诸如经由包含与模板可杂交但不完全互补的序列的引物引入的序列改变)和/或扩增期间发生的序列错误。50、术语“引物”，是指天然存在的寡核苷酸(例如限制性片段)或合成产生的寡核苷酸，其能够用作引物延伸产物合成的起始点，当处于适当的条件(例如缓冲液、盐、温度和ph)以及存在核苷酸和用于核酸聚合的试剂(例如依赖dna或依赖rna的聚合酶)的条件下，所述引物延伸产物与核酸链(模板或靶序列)互补。51、术语“探针”，是指可以具有任何合适的长度，例如15、20、30、40、50、100、150、200、300、500、1000或超过1000个核苷酸的长度。但是优选地是长度不少于10个核苷酸，并且优选的是长度不超过大约80个核苷酸；在一些实施方案中，探针的长度为大约20至60个核苷酸；在其他的实施方案中，探针的长度为大约20至40个核苷酸。探针还可以是适当修饰的，例如通过加入标记，如荧光标记、染料、放射性标记等。可以根据本领域技术人员已知的方法，通过标准的标记技术来标记本发明的探针，例如放射性标记、酶标记、荧光标记、生物素-亲和素标记、化学发光标记等。在杂交后，可以使用已知的方法来检测探针。52、术语“诊断”和/或“辅助诊断”，是指分子或病理状态、疾病或状况的鉴定或分类。其还可以指特定亚型的疾病的分类，例如通过分子特征(例如以特定基因或核酸区域中的核苷酸变异表征的患者亚群)来进行。53、术语“治疗”，是指涉及人类或动物(例如，被兽医所应用)的治疗，其中可达到某些预期的治疗效果，例如，抑制病症的发展(包括降低发展速度、使发展停止)、改善病症和治愈病症。还包括作为预防措施(例如预防)的治疗。对还没有发展为病症但有发展为该病症危险的患者的用途，也包括在本发明所述的术语“治疗”中。54、相对于现有技术，本发明具有的优点和有益效果：55、本发明首次发现突变型plekhh2蛋白(p.i1245t、p.s658f、p.p542s、p.a609t、p.y735c、p.r797x、p.t1240s)和/或突变型plekhh2基因(c.3734t>c、c.1973c>t、c.1624c>t、c.1825g>a、c.2204a>g、c.2389c>t、c.3718a>t)能够作为肺动脉高压的诊断标志物，通过检测受试者来源的样本中是否存在所述突变型plekhh2蛋白和/或突变型plekhh2基因，即可判断出该受试者是否患有肺动脉高压或患肺动脉高压的风险，所述诊断标志物可用于肺动脉高压的早期筛查、诊断、辅助诊断、风险预测和孕前预警中，此外，还可用于开发预防、延缓或治疗肺动脉高压的药物研究中，具有重要的科学研究和临床应用价值。当前第1页12当前第1页12