一种EBER和CD3全自动双染色的检测方法及其应用与流程

本发明涉及病毒检测，具体为一种eber和cd3全自动双染色的检测方法及其应用。

背景技术：

1、eb病毒(ebv)属于疱疹病毒，是传染性单核细胞多症的病因之一，也与自身免疫病和多种肿瘤相关，如burkitt淋巴瘤、鼻咽癌、毛细胞白血病和原发性中枢神经系统淋巴瘤。在淋巴组织中，ebv可感染b细胞、t细胞以及nk细胞，与多种疾病有关，ebv原位杂交法是检测病理组织或细胞涂片中ebv的常用方法。原位杂交检测eber能够定位ebv感染的细胞类型，是明确肿瘤与ebv相关的金标准。但有时在淋巴瘤病理诊断中，单纯性原位杂交和单纯性免疫组化的基础上难以精准判读ebv阳性细胞的种系，给诊断带来一定的困难。此时应用双染色技术，可以在同一张切片上清晰地观察到ebv阳性细胞是t淋巴细胞还是b淋巴细胞，有利于组织学判读，从而更加容易做出明确诊断。

2、eber原位杂交与免疫组化双染法目前在国内外仅见于少数科研报道，还未能在绝大多数病理科常规开展。主要是由于两项操作过程需要手工完成，步骤较复杂，互相影响因素多，不易取得理想效果。鉴于此，我们提出一种eber和cd3全自动双染色的检测方法及其应用，采用酶和碱的两次修复，完成eber和cd3的全自动双染色的检测方法。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种eber和cd3全自动双染色的检测方法及其应用，该eber和cd3全自动双染色的检测方法及其应用，解决了现有技术中eber原位杂交与免疫组化双染色方法由于两项操作过程需要手工完成，步骤较复杂，互相影响因素多，不易取得理想效果的问题。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、一种eber和cd3全自动双染色的检测流程，在杭州百殷生物科技有限公司的qpath48全自动免疫组化染色仪器中进行。包括以下检测步骤：

4、s1、加热块加热至80℃，持续2分钟；脱蜡液80℃孵育1分钟，重复4次；开启散热，酒精孵育1分钟，重复4次；开启散热，tbs清洗液清洗1分钟，重复4次；所述脱蜡液主要组分为二甲苯，所述tbs清洗液浓度为0.01mol/l；

5、s2、蛋白酶修复液37℃孵育12～20分钟；开启散热，tbs清洗液清洗1分钟，重复5次；

6、s3、过氧化物酶阻断剂(eber)孵育8分钟，tbs清洗液清洗1分钟，重复5次；eber探针(eber)孵育120分钟，tbs清洗液清洗1分钟，重复5次；地高辛一抗(eber)孵育30分钟，tbs清洗液清洗1分钟，重复5次；二抗增强剂(eber)孵育30分钟，tbs清洗液清洗1分钟，重复5次；二抗(eber)孵育30分钟，tbs清洗液清洗1分钟，重复5次，配置dab显色液；dab显色液孵育5分钟，tbs清洗液清洗1分钟，重复5次；

7、s4、抗原修复液清洗1分钟，重复2次；抗原修复液37℃孵育20分钟；开启散热20分钟；抗原修复液散热2分钟，重复2次；tbs清洗液散热2分钟，重复5次；

8、s5、一抗孵育30分钟，tbs清洗液清洗1分钟，重复5次；二抗增强剂孵育30分钟，tbs清洗液清洗1分钟，重复5次；二抗孵育30分钟，tbs清洗液清洗1分钟，重复5次；配置快红染色液；快红染色液孵育10分钟，tbs清洗液清洗1分钟，重复5次；

9、s6、将切片浸泡苏木素溶液中10～20秒，纯水清洗数秒，返蓝液返蓝1～5秒，纯水清洗后，烘干，水性封片剂封片；

10、优选地，本发明的应用流程可以使用在eber和cd5全自动双染色的检测方法，对染色程序进行进一步优化可以使用在eber和其他cd系列的双染的检测方法中。

11、本发明涉及的先eber检测后cd3染色的全自动双染色方法，eber原位杂交使用抗兔的hrp，dab显色，cd3免疫组化使用抗兔的ap，快红显色；

12、优选地，eber原位杂交使用抗兔的ap，快红显色，cd3免疫组化使用抗兔的hrp，dab显色，双染色效果优于先dab染色后快红染色；

13、本发明涉及两次修复，分别为酶修复和碱修复，酶修复为蛋白酶k修复，蛋白酶修复液组分为蛋白酶k，浓度为0.05mg/ml，可以使用0.05mol/l的tbs缓冲液进行稀释；所述步骤s4中的抗原修复液为0.7mol/l的氢氧化钠溶液，孵育温度为37℃，孵育时间为20分钟。优选地，本发明分别使用0.1m、0.3m、0.5m、0.7m、1.0m的氢氧化钠、37℃、45℃孵育温度和37分钟、45分钟孵育时间进行验证。结果显示，0.1m氢氧化钠45℃孵育5分钟效果最佳，0.5m和1.0m氢氧化钠37℃孵育5分钟效果最佳，延长孵育时间为10分钟或者提高温度至45℃都会导致脱片；

14、优选地，本发明可以对eber和cd5全自动双染色检测方法的染色程序进行优化，使其应用在eber和其他cd3的双染的检测方法中。可以采用酶修复加热修复或两次热修复，对修复过程进行改进；

15、优选地，采用两次热修复过程，需将温度控制在90℃～100℃之间，第一步修复的时间在10～20分钟以内，第二次修复时间控制在5～10分钟以内，以免修复时间过长造成抗原修复过度，影响染色效果；

16、本发明涉及的eber探针为eb病毒特异性靶点互补的由地高辛标记的dna序列，该序列为保护序列，其长度为35bp；

17、优选地，eber探针在该检测方法中不宜过长或过短，以20～100bp为宜，步骤三中的eber探针，分别设计了15bp、35bp、100bp、500bp、1000bp、2000bp，检测结果显示，15bp检测结果最弱，35～1000bp之间检测效果基本一致，而大于1000bp的探针序列因为其过长导致检测效果明显减弱；

18、本发明涉及dab显色液主要成分为二氨基联苯胺(3，3n-dia分钟obenzidinetertrahydrochloride)，避光保存，需现配现用，配置至使用时间不超过1小时；涉及的快红显色液主要组分为快红浓缩液和快红缓冲液，需避光保存，现配现用，配置至使用时间不超过10分钟；涉及两种二抗聚合物，包括二抗(eber)和二抗，其中二抗(eber)为hrp标记的酶标羊抗兔igg聚合物，二抗为ap标记的酶标羊抗兔igg聚合物，hrp标记的酶标羊抗兔igg聚合物可以催化dab在特定抗原结合位点生成棕色沉淀，ap标记的酶标羊抗兔igg聚合物可以催化快红在特定抗原结合位点生成红色沉淀；

19、优选地，两种二抗聚合物均可以选用hrp标记，催化不同的底物显不同的颜色，hrp标记的滴加酶标羊抗兔igg聚合物可以使dab显棕色或者氨乙基咔唑(aec)显红色，二抗(eber)选用ap标记的滴加酶标羊抗兔igg聚合物，使快红显色，二抗选用hrp标记的滴加酶标羊抗兔igg聚合物，使dab显棕色。结果显示，先快红显色后dab显色易于判读，颜色影响较小，更符合病理诊断医生的诊断要求；

20、一种eber和cd3全自动双染色应用，包括eber和cd3全自动双染色的检测方法在顺式双染色方面的应用，包括先eber检测后cd3染色试剂盒，所述试剂盒组成包括如下试剂，脱蜡液、无水乙醇、tbs、蛋白酶修复液、过氧化物酶阻断剂(eber)、eber探针(eber)、地高辛一抗(eber)、二抗增强剂(eber)、二抗(eber)、dab显色液、抗原修复液、一抗、二抗增强剂、二抗、快红染色液、苏木素染液、返蓝液和水性封片剂；

21、借由上述技术方案，本发明提供了一种eber和cd3全自动双染色的检测方法及其应用。至少具备以下有益效果：

22、(1)、本发明通过酶和碱两步修复过程，将eber原位杂交及cd3免疫组化染色有机结合，进行顺式双染色，可以在同一张切片上清晰地观察到ebv阳性细胞及cd3的染色结果，判断ebv阳性细胞的特性，该方法特异性好、阳性信号强，有利于病理诊断医师进行组织学判读，做出明确诊断。

23、(2)、本发明通过对切片样品进行双染色，从而使ebv阳性细胞可以与两种不同的抗体进行免疫反应并进行染色，从而可以避免样品的非特异性结合的概率，从而降低样品的假阳性概率，提升样品在进行组织学判读的准确性。