一种对凝胶中核酸和蛋白质进行染色分析的方法

本发明涉及分析化学，更具体地说，它涉及一种对凝胶中核酸和蛋白质进行染色分析的方法。

背景技术：

1、聚丙烯酰胺凝胶电泳(page)是核酸和蛋白质等生物分子分离、分析的重要手段，常被用于聚合酶链式反应、单链构象多态分析及蛋白质纯度、等电点和分子量的测定等，在分析化学、分子生物学以及有关学科的基础和应用研究中都获得了越来越广泛的应用和探究。因此，凝胶中核酸和蛋白质染色实现生物分子的成像，对于我们对生物信息的理解具有重要意义。

2、目前，对聚丙烯酰胺凝胶染色方法进行了很多研究，现在已经有了十分成熟的染色手段在实验中可供选择使用。对核酸染色的方法主要有溴化乙锭染色、可见染料和银染等；蛋白质染色方法主要有考马斯亮蓝染色、银染等。但国内外报道的染色方法分别存在以下缺点：一、使用试剂生物毒性强，具有高致癌性，在使用过程中可能危害人体健康；二、染色操作过程繁琐复杂，需要技术人员高超的实验技能来辅助完成；三、部分核酸荧光染料价格昂贵，且需要依赖大型凝胶成像仪的使用；四、大部分染色方法无法实现核酸与蛋白质等生物分子同时染色。针对以上问题，研究人员一直在寻找新的凝胶染色方法。

3、随着纳米科学的发展，人工合成的无机纳米材料与dna、蛋白质等生物分子之间的相互作用得到了广泛的研究。生物大分子可以设计等离子体纳米材料的特定组装，甚至可以控制它们的几何生长，已被用于开发新分析方法以实现生物免疫检测、蛋白标记。目前已有研究工作通过合成半胱氨酸掺杂的琼脂糖水凝胶，并基于氯金酸分子在水凝胶中的浸染作用构建了等离子体金纳米变色水凝胶，应用于重金属离子的分析。在水凝胶的保护下，金纳米粒子表现出很高的稳定性，其尺寸可以精确地调节，以改善等离子体性能；此外，金纳米材料生长过程中的化学反应导致信号放大，显著提高了目标识别性能。然而，目前仍没有相关研究将该金纳米浸染效应应用于二维凝胶中生物分子的染色识别。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种对凝胶中核酸和蛋白质进行染色分析的方法。将聚丙烯酰胺凝胶浸没于氯金酸溶液中，利用凝胶骨架上酰胺基团还原性在凝胶内部合成金纳米粒子，实现凝胶染色。利用核酸碱基、蛋白质与金纳米颗粒表面的相互作用调控金纳米粒子生长，通过凝胶颜色深浅变化对凝胶中核酸和蛋白质进行成像。该方法操作简单，具有较高的灵敏度和重现性，是一种更安全、便宜且便捷的二维凝胶染色分析方法。

2、本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种对凝胶中核酸和蛋白质进行染色分析的方法，包括如下步骤：

3、s1：制备聚丙烯酰胺凝胶、核酸进样液、蛋白质进样液，准备四氯金酸溶液；

4、s2：对水浴锅和气浴摇床进行预加热，设置加热温度为60℃；

5、s3：对一块聚丙烯酰胺凝胶泳道从左至右分别进行编号1-1、1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7和1-8，另一块聚丙烯酰胺凝胶泳道从左至右分别进行编号2-1、2-2、2-3、2-4、2-5、2-6和2-7，使用微量进样器向所述1-2～1-7和2-2～2-7泳道中均依次加入18μ l浓度均为3.0μm的dna-21进样液、dna-141进样液、rna-21进样液、rna-141进样液、双链dna-rna-21进样液和双链dna-rna-141进样液，向所述1-8泳道中加入18μl浓度为3.0mg/ml的牛血清白蛋白进样液，进行电泳分离处理；

6、s4：取两个染缸分别编号1、2，均装入8ml四氯金酸溶液并置于装有60℃热水的水浴锅中预加热3min，将电泳处理后1-1～1-7核酸条带、1-8蛋白质条带所对应位置的凝胶分别裁成两片宽为2cm的长方形凝胶片，将2-1～2-7处核酸条带均裁成宽为2cm的长方形凝胶片；将所述1-1～1-7泳道核酸凝胶片和1-8蛋白质凝胶片放入所述染缸1，将所述2-1～2-7泳道核酸凝胶片先放入凝胶红荧光染料中浸泡20min再放入所述染缸2。

7、s5：将步骤s4中所述的两个染缸放入步骤s1所述气浴摇床中金染，设置温度60℃，转速75rpm，染色60min后取出观察核酸和蛋白质条带。

8、本发明进一步设置为：步骤s1中对于所述聚丙烯酰胺凝胶为两块，将4.5ml纯水加入100ml烧杯中，打开磁力搅拌器，依次向烧杯中加入3.0ml 5×tbe缓冲液、7.5ml 40％的丙烯酰胺交联剂混合物(29∶1)、15μl temed和90μl浓度为10％过硫酸铵溶液制备得到制胶原液，迅速将所述制胶原液灌入制胶玻璃板内，灌满后玻璃板顶部加上加样梳，将所述制胶玻璃板放入37℃恒温培养箱中反应40min后取出，无需水洗纯化。

9、本发明进一步设置为：步骤s1中所述四氯金酸溶液浓度为5mm。

10、本发明进一步设置为：步骤s1中对于所述核酸进样液的制备，用100μl移液枪移取15.0μl浓度为10.0μm的核酸储备液(dna-21、dna-141、rna-21、rna-141)，装入无酶管中，依次加入30.0μl的1×te缓冲液和5.0μl浓度为50％的甘油混合均匀得到3.0μm单链核酸进样液；分别移取7.5μl浓度为10.0μm两条互补的单链核酸于无酶管中混合，将所述混合液置于95℃金属浴中加热5min，随后降温至25℃，制备得到杂交双链(dna-rna-21、dna-rna-141)。向所述杂交双链中加入30.0μl的1×te缓冲液和5.0μl浓度为50％的甘油混合均匀，得到总浓度为3.0μm双链核酸进样液。

11、本发明进一步设置为：步骤s1中所述蛋白质进样液的制备，称取0.0100g牛血清蛋白质于1.5ml离心管中，加入1.0ml纯水，剧烈搅拌制备得10.0mg/ml牛血清蛋白溶液，吸取15.0μl浓度为10.0mg/ml牛血清蛋白溶液于1.5ml离心管中，并加入30.0μl纯水和5.0μl浓度为50％的甘油混合均匀，得到3.0mg/ml蛋白质进样液。

12、本发明进一步设置为：步骤s4中所述凝胶红荧光染料浓度为2μg/ml，体积为20ml。

13、综上所述，本发明具有以下有益效果：将聚丙烯酰胺凝胶浸泡在氯金酸溶液中，在凝胶内部原位合成了金纳米颗粒，实现了凝胶染色。基于核酸和蛋白质对金纳米颗粒生长的抑制作用实现了凝胶中核酸和蛋白质的识别，且检测灵敏度均可达到ng/条带级别。该方法操作简单，具有较高的灵敏度和重现性，与现有技术相比是一种更安全、便宜且便捷的二维凝胶染色分析方法。

技术特征：

1.一种对凝胶中核酸和蛋白质进行染色分析的方法，该方法包括对经电泳分离核酸和蛋白质处理后的聚丙烯酰胺凝胶染色，其特征是：包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种对凝胶中核酸和蛋白质进行染色分析的方法，其特征是：步骤s1中对于所述聚丙烯酰胺凝胶为两块，将4.5ml纯水加入100ml烧杯中，打开磁力搅拌器，依次向烧杯中加入3.0ml 5×tbe缓冲液、7.5ml 40％的丙烯酰胺交联剂混合物(29：1)、15μl temed和90μl浓度为10％过硫酸铵溶液制备得到制胶原液，迅速将所述制胶原液灌入制胶玻璃板内，灌满后玻璃板顶部加上加样梳，将所述制胶玻璃板放入37℃恒温培养箱中反应40min后取出，无需水洗纯化。

3.根据权利要求1所述的一种对凝胶中核酸和蛋白质进行染色分析的方法，其特征是：步骤s1中所述四氯金酸溶液浓度为5mm。

4.根据权利要求1所述的一种对凝胶中核酸和蛋白质进行染色分析的方法，其特征是：步骤s1中对于所述核酸进样液的制备，用100μl移液枪移取15.0μl浓度为10.0μm的核酸储备液(dna-21、dna-141、rna-21、rna-141)，装入无酶管中，依次加入30.0μl的1×te缓冲液和5.0μl浓度为50％的甘油混合均匀得到3.0μm单链核酸进样液；分别移取7.5μl浓度为10.0μm两条互补的单链核酸于无酶管中混合，将所述混合液置于95℃金属浴中加热5min，随后降温至25℃，制备得到杂交双链(dna-rna-21、dna-rna-141)。向所述杂交双链中加入30.0μl的1×te缓冲液和5.0μl浓度为50％的甘油混合均匀，得到总浓度为3.0μm双链核酸进样液。

5.根据权利要求1所述的一种对凝胶中核酸和蛋白质进行染色分析的方法，其特征是：步骤s1中所述蛋白质进样液的制备，称取0.0100g牛血清蛋白质于1.5ml离心管中，加入1.0ml纯水，剧烈搅拌制备得10.0mg/ml牛血清蛋白溶液，吸取15.0μl浓度为10.0mg/ml牛血清蛋白溶液于1.5ml离心管中，并加入30.0μl纯水和5.0μl浓度为50％的甘油混合均匀，得到3.0mg/ml蛋白质进样液。

6.根据权利要求1所述的一种对凝胶中核酸和蛋白质进行染色分析的方法，其特征是：步骤s4中所述凝胶红荧光染料浓度为2μg/ml，体积为20ml。

技术总结本发明公开了一种对凝胶中核酸和蛋白质进行染色分析的新方法，涉及分析化学技术领域，其技术方案要点是：利用氯金酸溶液、新制聚丙烯酰胺凝胶，通过还原法在聚丙烯酰胺凝胶内部制备金纳米粒子实现凝胶染色。利用核酸碱基、蛋白质与金纳米颗粒表面的相互作用调控金纳米粒子生长，通过凝胶颜色深浅变化对凝胶中核酸和蛋白质进行成像。该方法操作简单，具有较高的灵敏度和重现性，是一种更安全、便宜且便捷的二维凝胶染色分析方法。技术研发人员：李帮林,彭萃铮,邹浩琳受保护的技术使用者：西南大学技术研发日：技术公布日：2024/11/4