一种富含人参皂苷功能稻的生物技术育种方法与流程

本发明属于生物育种，具体涉及一种富含人参皂苷功能稻的生物技术育种方法。

背景技术：

1、全世界有一半人口以大米作为主食。传统水稻育种从理论到技术都达到了很高的水平，为水稻提升产量做出了卓越的贡献，水稻基因组本身的基因资源已利用殆尽。近20年来，通过远缘杂交技术将外源基因转移到水稻中，科学家们基于该技术相继在玉米、小麦、水稻、棉花得到广泛的应用和验证。这些研究主要集中在提高作物的农艺性状和提高产量。

2、随着社会经济的发展，生活节奏加快，工作压力加大，亚健康人群激增，普通水稻功能化和药材主食化是大健康发展的重要趋势。

3、中药材中的植物活性成分，是植物在多样化代谢中适应环境、防御病虫害或者天敌中产生的次生代谢物(图1)，这些既是人类防治疾病的物质基础，也是新药研发的源泉(杨生超等，2023)。根据它们的生物合成途径，植物天然产物主要分为萜类、生物碱和酚类化合物三大类(图2)。20世纪70年代，我国周光宇先生提出了外源整体dna通过花粉管导入受体，进行杂交的分子育种。外源的dna片段和受体在杂交过程中的次生代谢物及活性成分即药用植物的功能性，通过花粉管进入胚囊，进而具有遗传性。

4、人参(panaxginsengc.a.mey.)是五加科(araliaceae)人参属(panax)植物，是传统的名贵中药材之一，其核心活性成分是人参皂苷，人参属的所有植物均具有较高的药用价值，如：适应原样作用、增强免疫力、抗肿瘤、抗动脉硬化、保护心肌作用等(张树臣,1992)。至今人参皂苷尚未能人工合成。人参是多年生草本植物，其栽培和生长条件特殊，对土壤和气候非常敏感，从而难以大规模地推广应用(张树臣,1992:李方元,2002)。

5、专利cn 103333914a公开了一种含有达玛烷型人参皂苷的水稻新种质的创制方法，通过将达玛烷型人参皂苷生物合成的关键酶—达玛烯二醇合成酶基因的全长cdna构建到双t-dna植物表达载体上，并遗传转化到水稻中；经过筛选培育，获得含有达玛烷型人参皂苷的水稻新种质。但该方法培育效率较低，实际应用成本较高。而目前将药用植物活性成分通过花粉管导入技术，叠加多次导入到受体中，从而创造出功能性农产品的研究报道较少。

技术实现思路

1、针对以上现有技术存在的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种富含人参皂苷功能稻的生物技术育种方法。本发明方法利用花粉管导入技术，将长白山的野生人参整体dna导入水稻，将人参中的活性成分人参皂苷转移到水稻中，并通过多次导入提高其人参皂苷含量，从而培育具有药用保健功能“人参皂苷稻”新品种。并扩大人参皂苷的来源，解决人参皂苷匮乏的问题。

2、本发明的另一目的在于提供一种通过上述方法得到的富含人参皂苷功能稻。

3、本发明目的通过以下技术方案实现：

4、一种富含人参皂苷功能稻的生物技术育种方法，包括如下步骤：

5、(1)采取ctab法提取供体人参的整体dna；

6、(2)采用花粉管导入技术，将提取的供体整体dna通过多次迭代转化至母体水稻中，对其产生的稻谷种进行筛选培育，得到富含人参皂苷功能稻。

7、进一步地，步骤(1)中所述人参优选长白山人参。

8、进一步地，步骤(1)中所述ctab法提取供体人参的整体dna的步骤如下：

9、1)称取供体幼苗的第一至第四个嫩叶，经表面清洁后液氮研磨成细粉，然后加入到60～70℃的ctab抽提液中恒温孵育；

10、2)将步骤1)的混合液冷却至室温，加入氯仿/异戊醇混合抽提匀浆液，使充分混合，离心取上清液，加入ctab/nacl混合溶液，充分混匀后再次加入氯仿/异戊醇，充分混合，离心抽提至上清液澄清；

11、3)将步骤2)的上清液加入到ctab沉淀液中混匀，室温静置后离心，弃上清；所得沉淀采用te缓冲液和rnasea储备液的混合溶液重悬，然后恒温孵育；

12、4)在步骤3)的混合溶液中加入预冷的无水乙醇混匀，离心取沉淀用乙醇水溶液清洗，晾干，加入te缓冲液溶解沉淀，得到供体人参的整体dna。

13、进一步地，步骤1)中所述恒温孵育的时间为30min。

14、进一步地，步骤2)和步骤3)中所述离心是指在4℃温度及10000r/min转速下离心5min；步骤4)中所述离心是在4℃温度及10000r/min转速下离心15min。

15、进一步地，步骤2)中所述ctab/nacl混合溶液的加入量为上清液体积的1/10。

16、进一步地，步骤3)中所述恒温孵育是指在37℃恒温孵育30min。

17、进一步地，步骤4)中所述乙醇水溶液是指浓度为70％的乙醇水溶液。

18、进一步地，步骤(2)中所述母体水稻为野生稻或常规稻。

19、进一步地，步骤(2)中所述采用花粉管导入技术，将提取的供体整体dna通过多次迭代转化至水稻中，对其产生的稻谷种进行筛选培育的具体步骤如下：

20、a、在母体水稻开花后将颖壳剪开一小部分，去掉颖壳内雄花和已经开过的或未开过的花朵，保留正在开的花朵，将供体整体dna导入颖壳内，然后套袋培育至收获谷种；

21、b、对步骤a收获的谷种进行人参皂苷含量测定，筛选优良变异株；

22、c、将所得优良变异株按照步骤a和b进行迭代转化后培育，得到富含人参皂苷功能稻。

23、进一步地，步骤a中所述母体水稻开花后是指在母体水稻开花后2～4h内。

24、一种富含人参皂苷功能稻，通过上述方法得到。

25、本发明原理为：

26、通过中医药学典籍结合现代医学检测数据，优选药用植物的三类活性成分含量高、发展前景好的药用植物作为供体，到本发明具体实施优选的供体是长白山人参，野生稻或者常规稻作为受体(母体)。通过花粉管导入技术和多次迭代转化，成功的获得了富含人参皂苷的优良变异株。

27、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

28、本发明通过目标功能稻供体的选择和药用植物次生代谢的作用结合，选择该类化合物含量高的药用植物，萜类化合物中人参皂苷含量高的人参，通过采用花粉管导入技术，按照ctab法提取供体的dna，再整体dna导入到受体的花粉管中，激发了药用植物人参的次生代谢物的释放；为了增强其功能性，将已经提取的dna多次迭代导入到最新研发版本的水稻中。实验结果证明，随着人参迭代导入的次数，导入后的水稻人参皂苷呈梯形加速度增长。本发明可以研发药用价值的功能型农产品；而且可以通过迭代导入药用植物的dna增加其药用功能。从而根据本发明，研发系列功能型农产品，提高作为普通功能型农产品如：稻米保健价值；同时可拓宽人参皂苷的来源，促进人参皂苷匮乏的问题的缓解，有极强的应用前景。

技术特征：

1.一种富含人参皂苷功能稻的生物技术育种方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种富含人参皂苷功能稻的生物技术育种方法，其特征在于，步骤(1)中所述人参为长白山人参。

3.根据权利要求1所述的一种富含人参皂苷功能稻的生物技术育种方法，其特征在于，步骤(1)中所述ctab法提取供体人参的整体dna的步骤如下：

4.根据权利要求3所述的一种富含人参皂苷功能稻的生物技术育种方法，其特征在于，步骤1)中所述恒温孵育的时间为30min；步骤3)中所述恒温孵育是指在37℃恒温孵育30min。

5.根据权利要求3所述的一种富含人参皂苷功能稻的生物技术育种方法，其特征在于，步骤2)和步骤3)中所述离心是指在4℃温度及10000r/min转速下离心5min；步骤4)中所述离心是在4℃温度及10000r/min转速下离心15min。

6.根据权利要求3所述的一种富含人参皂苷功能稻的生物技术育种方法，其特征在于，步骤2)中所述ctab/nacl混合溶液的加入量为上清液体积的1/10；步骤4)中所述乙醇水溶液是指浓度为70％的乙醇水溶液。

7.根据权利要求1所述的一种富含人参皂苷功能稻的生物技术育种方法，其特征在于，步骤(2)中所述母体水稻为野生稻或常规稻。

8.根据权利要求1所述的一种富含人参皂苷功能稻的生物技术育种方法，其特征在于，步骤(2)中所述采用花粉管导入技术，将提取的供体整体dna通过多次迭代转化至水稻中，对其产生的稻谷种进行筛选培育的具体步骤如下：

9.根据权利要求8所述的一种富含人参皂苷功能稻的生物技术育种方法，其特征在于，步骤a中所述母体水稻开花后是指在母体水稻开花后2～4h内。

10.一种富含人参皂苷功能稻，其特征在于，通过权利要求1～9任一项所述的方法得到。

技术总结本发明属于生物育种技术领域，公开了一种富含人参皂苷功能稻的生物技术育种方法。所述育种方法包括如下步骤：(1)采取CTAB法提取供体人参的整体DNA；(2)采用花粉管导入技术，将提取的供体整体DNA通过多次迭代转化至母体水稻中，对其产生的稻谷种进行筛选培育，得到富含人参皂苷功能稻。本发明方法利用花粉管导入技术，将长白山的野生人参整体DNA导入水稻，将人参中的活性成分人参皂苷转移到水稻中，并通过多次导入提高其人参皂苷含量，从而培育具有药用保健功能“人参皂苷稻”新品种。并扩大人参皂苷的来源，解决人参皂苷匮乏的问题。技术研发人员：刘小民受保护的技术使用者：刘小民技术研发日：技术公布日：2024/11/14