一种载PDGF-BBmRNA的纳米复合物及其制备方法与应用

本发明属于药物制剂，具体涉及一种载pdgf-bb mrna的纳米复合物及其制备方法与应用。

背景技术：

1、动脉粥样硬化(atherosclerosis，as)易损斑块因病情隐匿，往往导致急性心肌梗塞、短暂性脑缺血发作和中风等严重后果。目前，全球治疗as最多的关注点仍然是低密度脂蛋白氧化应激所引起的系列事件的预防与干预，尽管这些措施取得了不错的治疗效果，但对于内部成分复杂、各种机制交错影响的晚期易损斑块，单纯药物治疗无法获得完全满意的结果，而手术介入的风险依然会给患者和家庭带来沉重的负担。易损斑块的典型特征为大的脂质核心，薄纤维帽、病理性新生血管和炎细胞浸润等，越来越多的证据表明，病理性新生血管的完整性受损和血管壁渗漏是斑块不稳定和破裂的重要促成因素。因此，针对晚期as斑块，以恢复斑块内新生血管结构和功能的完整性，打破缺氧-促血管生成的恶性循环的方案具有治疗潜力。纤维帽厚度是影响斑块稳定性的另一关键要素，各种来源的细胞和细胞分泌的胶原纤维共同组成了斑块纤维帽，纤维帽覆盖于深部大量脂质上发挥支撑作用，其厚薄与斑块的稳定性密切相关。纤维帽太薄则无法保护斑块的安全稳定，纤维帽过厚又会加重斑块的内部缺氧。

2、因此，结合晚期易损斑块的两大影响因素——新生血管和纤维帽厚度，以促进新生血管成熟缓解管壁缺氧控制血管新生、以适当增大纤维帽厚度保护斑块，是一个值得开发的稳定易损斑块的新策略。

3、mrna在包括病毒疫苗、蛋白质替代疗法、癌症免疫疗法、细胞重编程和基因组编辑等一系列应用中极具潜力，成为预防和治疗疾病的一种新药物。为确保mrna在体内发挥作用，需要安全、有效和稳定的递送系统以保护核酸不被降解，并允许细胞和释放mrna。

4、随着纳米技术的不断发展，脂质纳米粒(lipid nanoparticles，lnp)载mrna技术治疗新冠病毒的成功应用，使其再次成为研究热点。虽已有大量关于使用脂质纳米粒包裹mrna的相关实验研究，但其功能大多较为单一，如不具有靶向性、转染细胞的效率低下、过早降解以及无法在体内进行可视化递送等。这些不足不仅限制了药物的疗效，甚至会给患者带来全身副作用，加重患者身体及经济负担。

技术实现思路

1、本发明意在提供一种载pdgf-bb mrna的纳米复合物及其制备方法与应用，以期提供具有靶向性、保护性、可视化性及响应性优势的纳米复合物，为动脉粥样硬化晚期易损斑块的治疗提供新的药物设计思路。

2、为了达到上述目的，本发明提供一种载pdgf-bb mrna的纳米复合物的制备方法，包括以下步骤：

3、s1、制备载pdgf-bb mrna的lnp：将7c1阳离子脂质体与聚乙二醇混合并使用无水乙醇溶解，得到脂相；将pdgf-bb的mrna溶解在ph为4、浓度为10mmol/l的柠檬酸钠缓冲液中，得到水相；将脂相与水相快速混合，得到lnpmrna，随后立即在ph为7.4的pbs缓冲液中透析过夜，得到lnpmrna溶液；

4、s2、制备plga气核核心：将plga加入至二氯甲烷中，充分溶解后加入全氟正戊烷，超声震荡至溶液变为白色乳液，将聚乙烯醇溶液加入至白色乳液中，再次超声震荡，后加入异丙醇溶液，低温蒸发二氯甲烷；二氯甲烷蒸发后低温离心、洗涤，收集沉淀，使用ph为4、浓度为10mmol/l的柠檬酸钠缓冲液重悬保存，得到plga气核核心溶液；本步骤全程冰面操作；

5、s3、制备lnpmrna@plga纳米复合物：将步骤s1中的lnpmrna溶液与步骤s2中的plga气核核心溶液混合，静置后得到lnpmrna@plga纳米复合物。

6、可选地，步骤s1中7c1阳离子脂质体与步骤s2中plga的质量比为0.5～32:1。

7、可选地，步骤s1中7c1阳离子脂质体与步骤s2中plga的质量比为16:1。

8、可选地，在步骤s1中，脂相与水相混合过程中，脂相的流速为3ml/min，水相的流速为9ml/min。

9、可选地，在步骤s1中，7c1阳离子脂质体与聚乙二醇的质量比为4:1。

10、可选地，在步骤s1中，脂相与水相的体积比为1:3。

11、可选地，在步骤s2中，全氟正戊烷加入后超声震荡的条件为：功率90w/s，以运行5s停止5s的频率超声1min。

12、可选地，在步骤s2中，聚乙烯醇溶液加入后超声震荡的条件为：功率90w/s，以运行5s停止5s的频率超声3min。

13、可选地，在步骤s2中，聚乙烯醇溶液的质量浓度为4％。

14、可选地，在步骤s2中，异丙醇溶液的质量浓度为2％。

15、可选地，在步骤s2中，二氯甲烷蒸发后离心转速为5000rpm，离心时间为10min。

16、本发明还提供了一种上述制备方法制得的载pdgf-bb mrna的纳米复合物，该载pdgf-bb mrna的纳米复合物具有靶向性、保护性、可视化性及响应性的优势，能够应用在制备治疗动脉粥样硬化晚期易损斑块药物中。

17、本方案的工作原理及有益效果在于：本方案针对影响斑块稳定性的两大因素——病理性新生血管和纤维帽厚度，一方面促进周细胞募集，加强动脉粥样硬化斑块新生血管内皮细胞与周细胞间相互作用，恢复新生血管壁的完整性与功能，缓解缺氧以抑制病理性血管生成，并阻止血管内容物渗漏稳定斑块；另一方面刺激血管平滑肌细胞由收缩表型转化为合成表型，并逐渐迁移到斑块受损处内膜形成纤维帽以稳定斑块的治疗策略。

18、如此，本方案中，将pdgf-bb的mrna作为药物核心，采用7c1可电离脂质体包载mrna，并与plga气核核心以正负电荷吸引的方式结合，7c1 lnp不仅具有良好的ph敏感性，还具有特异靶向血管内皮细胞的功能，最终组成具有多重效能的lnpmrna@plga纳米递送平台。在体外聚焦超声的触发下，实现plga气核核心“定时定点”爆破，释放lnpmrna，使其转染斑块新生血管内皮细胞，促进血管内皮过表达pdgf-bb，从而启动“促血管成熟”与“增大纤维帽厚度”双重效应，最终实现稳定斑块的治疗目标。并且，本方案与传统脂质纳米粒的合成方案相比，本方案的脂质纳米合成只需两种脂质成分，且无需额外连接靶向配体，提高药物在体内的安全性；且本方案的步骤s1中，在前期药物(脂相与水相)准备好的前提下，可在1分钟内完成脂质纳米粒的合成，大大提高了制药效率。

技术特征：

1.一种载pdgf-bb mrna的纳米复合物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤s1中7c1阳离子脂质体与步骤s2中plga的质量比为0.5～32:1。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤s1中7c1阳离子脂质体与步骤s2中plga的质量比为16:1。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在步骤s1中，脂相与水相混合过程中，脂相的流速为3ml/min，水相的流速为9ml/min。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在步骤s1中，7c1阳离子脂质体与聚乙二醇的质量比为4:1；和/或，

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在步骤s2中，全氟正戊烷加入后超声震荡的条件为：功率90w/s，以运行5s停止5s的频率超声1min；和/或，

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在步骤s2中，聚乙烯醇溶液的质量浓度为4％；和/或，

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在步骤s2中，二氯甲烷蒸发后离心转速为5000rpm，离心时间为10min。

9.如权利要求1-8中任一项所述的制备方法制得的载pdgf-bb mrna的纳米复合物。

10.如权利要求9所述的纳米复合物在制备治疗动脉粥样硬化晚期易损斑块药物中的应用。

技术总结本发明属于药物制剂技术领域，具体涉及一种载PDGF‑BB mRNA的纳米复合物的制备方法，该制备方法包括：1)制备载PDGF‑BB mRNA的LNP：将含7C1阳离子脂质体的脂相与含PDGF‑BB的mRNA的水相快速混合，得到LNPmRNA；2)采用双乳液法制备PLGA气核核心；3)将步骤2)中的PLGA气核核心与步骤1)中的LNPmRNA混合，静置得到LNPmRNA@PLGA纳米复合物。本发明的LNPmRNA@PLGA纳米复合物具有保护性、靶向性、可视性以及响应性优势，其联合体外聚焦超声，不仅可以实现药物的可视化递送，还可以定性及半定量评估晚期动脉粥样硬化斑块中的新生血管，且在体外聚焦超声的靶向微泡破坏效应下提高细胞转染效率，精准高效地过表达目标蛋白，实现药物治疗的目标，减少全身毒副作用。技术研发人员：孙阳,李鑫鑫,谢奇容,刘帆,黄荣忠,程潇潇,骆健豪受保护的技术使用者：重庆医科大学技术研发日：技术公布日：2024/11/18