一种基于SnO2/NiCo2O4的夹心型光电化学免疫传感器的制备方法及应用

本发明属于免疫传感器的，更具体涉及一种基于sno2/nico2o4的夹心型光电化学免疫传感器的制备方法及应用。

背景技术：

1、中国具有悠久的使用皮革制品的历史。早在远古时期,人们就开始在兽皮上涂抹油脂,经过一定的加工,将兽皮制成皮革。而皮质文物作为一种有机高分子材料,在历经千百年岁月的洗礼之后,其中的胶原蛋白受环境的影响往往产生严重的劣化现象,劣化的皮质文物无论是外貌形态还是内部结构都发生了巨大的改变,这使得一些常规的检测手段,如表面分析、光谱分析、dna分析等,难以对皮质文物的物种进行准确鉴别。加之文物的珍贵性，急需开发可交叉验证的无损检测手段对古代皮质文物进行种属鉴别。电化学免疫传感器作为一种新型的检测方式在文皮革文物检测上发挥着巨大作用。

2、二氧化锡(sno2)由于其合适的带隙(3.5～4.0v)、优异的光催化性能和独特的结构以及优异的物理化学稳定性而备受关注。然而，二氧化锡的应用因其严重的光腐蚀而受到限制。为了克服这一问题，二氧化锡可以与其他光活性材料结合形成异质结构，从而增加光稳定性并抑制电子-空穴(e/h+)对的快速复合。在这些被测光活性材料中，尖晶石结构的nico2o4因其成本低、物理化学性质稳定、电化学性能优异而受到广泛关注。此外，nico2o4具有ni3+/ni2+和co3+/co2+的氧化还原电子对，具有较好的导电性和电化学活性。虽然nico2o4已广泛应用于超级电容器、电催化和锂硫电池中，但其作为光电活性物质在pec免疫测定中的应用尚未得到广泛开发。

技术实现思路

1、本发明旨在提供一种基于sno2/nico2o4的夹心型光电化学免疫传感器的制备方法及应用，通过复合修饰法制备出性能优越的sno2/nico2o4材料，进一步优化光电转换活性，以sno2/nico2o4为基底制备出一种灵敏度高、特异性强、检测速度快的夹心型光电化学免疫传感器，实现可见光条件下对胶原蛋白的超灵敏检测。

2、为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：一种基于sno2/nico2o4的夹心型光电化学免疫传感器的制备方法包括如下步骤:

3、步骤一：纳米sno2制备：将sncl4·5h2o溶解于水中,待溶液完全澄清后依次加入柠檬酸、葡萄糖、丙烯酰胺、双丙烯酰胺，同时搅拌溶解,用氨水调节其ph，加热使混合溶液发生热聚合反应；反应结束后，所得凝胶干燥、研碎后烧结，得到纳米sno2粉末；

4、步骤二：sno2/nico2o4制备：将纳米sno2粉末加入到无水乙醇中，超声处理，直至完全溶解形成溶液；将nicl2·6h2o、cocl2·6h2o、碳酸氢铵溶解于乙二醇中，转移至反应釜中加热反应，冷却后洗涤离心，干燥后得到sno2/nico2o4粉末；

5、步骤三：au@co3o4-ab2制备：将co3o4、haucl4溶液和pvp加入到水中，在搅拌条件下滴入柠檬酸三钠溶液，再滴入nabh4溶液，搅拌直至颜色不变，离心洗涤所得溶液，之后干燥得到au@co3o4粉末；取au@co3o4溶液与ab2溶液混合，振荡孵育，离心洗涤后在pbs缓冲液中分散，得到au@co3o4-ab2溶液；

6、步骤四：免疫传感器的自组装：将sno2/nico2o4溶液、pdatris-hcl溶液、ab1溶液、bsa溶液，au@co3o4-ab2溶液依次滴加到ito电极上，得到免疫传感器。

7、为突破传统传感器在灵敏度、种属特异性和稳定性等方面的限制，本发明通过sno2/nico2o4复合材料的异质结构，加速电荷转移，抑制e/h+对的重组，从而增强信号。此外，au nps作为贵金属具有良好的生物相容性，将其修饰在co3o4表面，以促进ab2与标记物的结合，并提高电导率。因此选用具有良好导电性和光催化性能的au@co3o4作为ab2标记物进行信号放大，利用鼠抗皮革胶原蛋白单克隆抗体(ab2)作为免疫探针，通过特异性抗体抗原反应将活性分子修饰到电极表面，成功构建了具有放大信号的au@co3o4标记pec免疫传感器。

8、所得传感器具有出色的灵敏度、特异性、稳定性和重现性等响应性能，实现可见光条件下对皮革文物中胶原蛋白的超灵敏检测。

9、在可见光照射下，sno2/nico2o4纳米复合材料的光电流信号是sno2的7倍：在808nm近红外光照射下，sno2/nico2o4纳米复合材料的光电流信号是sno2的25倍，表明sno2/nico2o4和au@co3o4之间拥有匹配的能带结构。本发明构建的传感器在0.005～50ng/ml范围内，得到线性拟合方程：ai＝2.732+0.9281gc(r’＝0.9974)，最低检测限经计算为1.36pg/ml。

10、进一步优选的，步骤一中，所述sncl4·5h2o溶解于水中，sncl4·5h2o与水的添加量之比为0.16-0.16g：15ml；所述柠檬酸与溶液中sn4+的摩尔比为(1.5-2)∶1；所述葡萄糖与水的添加量之比为15-20g：15ml；所述丙烯酰胺与溶液中sn4+的摩尔比为(9-10)∶1；所述双丙烯酰胺与丙烯酰胺的摩尔比为(3-5)∶1。

11、进一步优选的，步骤一中，用氨水调节其ph为3.5-4.0；所述热聚合反应的温度为80-90℃，反应时间为30-50min；所述凝胶干燥为在120-160℃干燥12-24h；所述烧结为在350-400℃烧结3-5h。

12、进一步优选的，步骤二中，所述纳米sno2粉末与无水乙醇的添加量之比为72-80mg：30ml；所述nicl2·6h2o、cocl2·6h2o、碳酸氢铵与乙二醇的添加量之比为0.39-0.40g：0.95-0.96g：3.9-4.0g：150ml；反应釜中加热反应为在180-200℃反应12-24h。

13、进一步优选的，步骤三中，所述co3o4的制备包括：称量0.238-0.240g co(no3)2·6h2o和0.79-0.81g nh4hco3，依次加入30ml乙二醇中，搅拌至完全溶解为透明溶液。将上述溶液倒入50ml特富龙热压釜中，在180-200℃下加热3-5h。并转入反应釜中加热反应，反应结束后，离心洗涤、干燥，得到co3o4粉末。

14、进一步优选的，所述naoh、乙二醇、co(no3)2·6h2o的添加量之比为0.36-0.42g：15ml:0.28-0.33g；所述赖氨酸、乙二醇、fecl3·6h2o的添加量之比为0.87-0.90g：25ml:0.27-0.31g；反应釜中加热反应为在180-200℃反应10-12h。

15、进一步优选的，步骤三中，所述co3o4、haucl4溶液、pvp、水、柠檬酸三钠溶液、nabh4溶液的添加量之比为10-12mg：1.5-1.8ml：7-9mg：10ml：3-5ml：3-5ml；所述haucl4溶液的浓度为1-2wt％；所述柠檬酸三钠溶液的浓度为40-45mg/ml；所述nabh4溶液的浓度为(20-40)％；所述搅拌直至颜色不变的时间为12-14h；所述au@co3o4溶液与牛胶原蛋白抗体ab2溶液的体积比为1ml：5-8μl。

16、进一步优选的，步骤四中，用30-50μl的4.10-4.12mg/ml sno2/nico2o4悬浮液滴涂ito裸电极，室温干燥得到ito/sno2/nico2o4电极。将ito/sno2/nico2o4电极置于4-6mg/ml盐酸多巴胺的tris-hcl(ph＝8.5)溶液中4℃孵育过夜，然后用0.1-0.3m pbs(ph＝7.5)冲洗并干燥。在电极表面修饰10-30μlab1溶液。然后，在电极表面滴加6-8μl牛血清白蛋白(bsa,1wt％)，4℃孵育2-4)h，阻断非特异性结合位点。然后，在上述电极表面滴加10-12μl胶原蛋白抗原溶液,4℃孵育2-4h。最后，加入10-30μlau@co3o4-ab2溶液，得到免疫传感器。

17、本发明的技术方案之二：一种上述制备方法得到的免疫传感器在胶原蛋白免疫检测中的应用。

18、相比于现有技术，本发明具有以下优点：

19、(1)本发明制备的夹心型光电化学免疫传感器，用于胶原蛋白的检测，响应时间短，检测限低，线性范围宽，稳定性好，可以实现简单、快速、高灵敏和特异性检测，为皮革文物样的检测提供了一种全新的分析方法

20、(2)本发明通过金属纳米颗粒会增加材料整体的导电率与反应速率引入金纳米颗粒。

21、(3)本发明制备出的电极不需要任何额外导电剂、粘结剂的添加，与传统涂敷法和辊压等机械法相比材料负载更均匀有效，更简单，电阻更小。

22、(4)本发明所用材料生物相容性好、绿色无污染，制备流程简单，省时省力且自组装过程易检测、可修饰。