一种基于AIECL的电化学发光免疫传感器的制备方法及应用

本发明涉及生物检测，具体涉及一种基于聚集诱导电致化学发光(aggregation-induced electrochemiluminescence aiecl)的电化学发光免疫传感器的制备方法及应用，更具体涉及一种具有高效分子内电荷转移(ict)效应和高度扭曲分子构象的新型aiecl发光体(bdppanps)。由于高效的分子内电荷转移以及高度扭曲的构象导致聚集态的发光效率增强，构建了一种无标记ecl免疫传感器，用于高灵敏度检测sars-cov-2n蛋白。

背景技术：

1、电化学发光(ecl)是电极通过一系列氧化还原反应产生高能物质的发光现象，因其不需要额外光源、背景低、可控性强和灵敏度高等独特优势，ecl已成为ecl器件、生物分析和生物成像等领域中敏感分析技术的重要手段。最近，聚集诱导电化学发光(aiecl)引起了人们广泛的兴趣因其结合了聚集诱导发射(aie)和ecl优点。通过限制分子内部自由旋转和扭曲，聚集态的ecl响应显著增加。目前已经开发了各种有机和无机aiecl体系：有机体系包括由有机小分子形成的点状聚集体和纳米晶体；无机体系则包括金属配合物和金属纳米簇。然而，在无机系统中开发的aiecl体系主要由贵金属(如au、pt、ru等)和稀有金属(如zr等)组成，这些材料存在着成本昂贵、合成条件严苛以及反应步骤复杂等问题。相比之下，有机系统因其结构多样性、低成本性以及可调节光物理性能等优势而被认为是aiecl领域的优异候选者之一。毫无疑问，目前有机aiecl发光体在水介质中的ecl响应超过了有机系统中分散的分子态。然而，聚集体内密集排列的分子会导致明显的内部滤光效应和自猝灭效应，限制了ecl效率。因此，探索具有高ecl效率、经济实惠且低生物毒性的新型aiecl有机发光体是一个值得研究的课题。因此，设计具有扭曲结构的有机分子是开发具有聚集诱导发光(aie)和aiecl性质的新型发光体的一种有前景的方法。此外，在共轭聚合物中有效调控给体-受体(d-a)基团内部分子间电荷转移已被证实可以提高aiecl性能。因此，将扭曲的分子结构和给体-受体(d-a)基团内部分子间电荷转移纳入到分子结构中是开发新型aiecl荧光体的一种有前景策略。

2、在此基础上，首次为aiecl开发了一种具有高度扭曲分子构象和高效分子内电荷转移跃迁的新型a-π-d-π-a分子(bdppa)，bdppanps在阳极和阴极上表现出强大的ecl。这将为寻找高效的aiecl发光体开辟了道路，为开发生物传感、发光器件和ecl成像的高效平台提供了参考。相关内容尚无文献公开。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的是开发一种新型的aiecl发射体(bdppanps)，其中有效的分子内电荷转移效应和高度扭曲的构象有助于显著增强ecl。ict效应减少了电子转移路径，而扭曲构象有效地限制了π-π堆积和分子内运动。与[ru(bpy)32+]/tpra的标准ecl系统相比，其ecl发光效率(φecl)可高达54％，并可通过共反应物路线直接观察ecl，此外构建了一个高灵敏度的sars-cov-2n蛋白生物传感平台。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供了一种基于分子内电荷转移和扭曲分子构象的高效聚集诱导电化学发光免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：

3、步骤1、制备bdppa小分子；

4、步骤2、纳米沉淀法合成bdppanps；所得产物呈现出球状，具有良好的分散性；bdppanps具有受体-共轭桥-供体-共轭桥-受体(a-π-d-π-a)的结构，其具有优异的共反应剂型ecl。

5、步骤3、电化学发光免疫传感器的构建：

6、s1.分别用1.0、0.3和0.05μm氧化铝粉对gce进行抛光，然后用超声波在乙醇和超纯水中交替清洗。

7、s2.将6μl制备的bdppanps(160μg ml-1)分散体浇上gce表面，在25℃下干燥，制备bdppanps/gce。

8、s3.将上述nps修饰的gce浸在交联剂(20mm 1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(edc))和10mmn-羟基琥珀酰亚胺(nhs)在室温下孵育30min。

9、s4.将4μl ab(10μg/ml)与修饰电极在4℃下孵育12h(ab/bdppa nps/gce)，再与4μlbsa(1％)(bsa/ab1/bdppanps/gce)在25℃下孵育30min，以防止非特异性吸附。

10、s5.将10μl不同浓度的sars-cov-2n蛋白与修饰电极bsa/ab1/bdppa nps/gce在37℃下孵育60min，制备出抗原抗体特异性识别的无标记免疫传感器。每个修饰步骤后，使用pbs(0.01m，ph 7.4)去除弱结合成分。

11、上述基于分子内电荷转移和扭曲分子构象的高效聚集诱导电化学发光免疫传感器用于sars-cov-2n蛋白定量分析应用。基于bdppanps/tpra体系优异的阳极ecl性能，以bdppanps为探针，建立了一种典型的无标记免疫传感器。通过优化ph值和孵育时间，获得合适的检测条件。在最优条件下，随着n蛋白浓度的增加，ecl强度逐渐降低，为sars-cov-2n蛋白检测提供了一个指标。

12、与现有技术相比，本发明的有益效果：

13、(1)首先合成了bdppa小分子，之后采用纳米共沉淀法制备了bdppanps，所得产物呈现球状，且具有良好的分散性；bdppanps具有受体-共轭桥-供体-共轭桥-受体体(a-π-d-π-a)的结构，其具有优异的共反应剂ecl行为。

14、(2)以bdppanps为探针，建立了一种典型的无标记免疫传感器。所制备的bdppanps由于聚集诱导的高扭曲构象下的ecl发射增强，提供了强烈的阳极ecl信号。同时，在分子结构中引入d-a基团，实现高效的ict效应，从而提高aiecl的ecl性能。有助于sars-cov-2n蛋白的灵敏检测。此外，所提出的策略在检测水溶液和人血清中的sars-cov-2n蛋白方面表现出优异的特异性、灵敏度和可靠性。

15、(3)与[ru(bpy)32+]/tpra的标准系统相比，其ecl发光效率(φecl)可高达54％，有效的分子内电荷转移(ict)效应和高度扭曲的构象显著提高了其ecl发光效率，ecl效率的提高表明aiecl在提高ecl效率和促进生物传感应用方面具有重要的应用价值。

技术特征：

1.一种基于aiecl的电化学发光免疫传感器的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种基于aiecl的电化学发光免疫传感器的制备方法，其特征在于，步骤1具体包括：

3.根据权利要求1所述的一种基于aiecl的电化学发光免疫传感器的制备方法，其特征在于，步骤2具体包括：

4.根据权利要求1所述的一种基于aiecl的电化学发光免疫传感器的制备方法，其特征在于，步骤3具体包括：

5.根据权利要求4所述的一种基于aiecl的电化学发光免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述交联剂为1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺。

6.根据权利要求4所述的一种基于aiecl的电化学发光免疫传感器的制备方法，其特征在于，步骤(1)中分别用1.0、0.3和0.05μm氧化铝粉对gce进行抛光。

7.根据权利要求4所述的一种基于aiecl的电化学发光免疫传感器的制备方法，其特征在于，步骤(2)中bdppanps的浓度为160μg ml-1。

8.根据权利要求4所述的一种基于aiecl的电化学发光免疫传感器的制备方法，其特征在于，步骤(3)中交联剂的浓度为20mm，nhs的浓度为10mm。

9.根据权利要求4所述的一种基于aiecl的电化学发光免疫传感器的制备方法，其特征在于，步骤(4)中ab与bdppanps/gce在4℃下孵育12h，再与bsa在25℃下孵育30min。

10.由权利要求1-9任一所述制备方法制备的电化学发光免疫传感器在sars-cov-2n蛋白定量分析中的应用。

技术总结本发明属于生物检测技术领域，公开了一种基于聚集诱导电化学发光(AIECL)的电化学发光免疫传感器的制备方法及其检测SARS‑CoV‑2N蛋白的应用。该传感器采用具有高效分子内电荷转移(ICT)效应和高度扭曲分子构象的新型AIECL发光体BDPPA纳米粒子(BDPPANPs)。通过纳米沉淀法制备的BDPPANPs在聚集状态下实现了电化学发光效率(ΦECL)的显著提高。相比于传统的[Ru(bpy)32+]/TPrA体系，该发光体系的ECL发光效率高达54％，并且可以直接通过共反应物途径进行可视化观察，还构建了一种无标记的电化学发光免疫传感器，用于检测SARS‑CoV‑2N蛋白，所构建的ECL免疫传感器具有较宽的线性检测范围(0.001‑500ng mL‑1)和极低的检测限(0.28pg mL‑1)。技术研发人员：吴丽,刘金霞,秦玉岭,明文珺,张晶受保护的技术使用者：南通大学技术研发日：技术公布日：2024/11/18