乳源外泌体的提取和鉴定方法

本发明属于生物，具体涉及乳源外泌体的提取和鉴定方法，更具体而言，涉及一种基于琼脂糖凝胶电泳的乳源外泌体的提取和鉴定方法。

背景技术：

1、外泌体(exosomes，ev)是由具有生物活性的细胞通过胞吐作用，形成的具有茶托状或椭圆形，直径在30～200nm，密度在1.1-1.2g/ml的具有双层膜状结构的囊泡(引用文献1)。外泌体存在于多种组织液中，例如牛乳中富含大量外泌体。乳源外泌体被磷脂双层膜包围，携带多种物质，包括蛋白质如四跨膜蛋白(cd9，cd63和cd81)、肿瘤易感基因101蛋白(tsg101)以及其他活性物质(如维生素、矿物质、脂质等)，人们在摄入牛乳的同时会摄入牛乳中的外泌体。此外，外泌体在免疫应答、信号转导、牛乳房炎的疾病诊断、药物递送载体等多个领域具有重要的研究意义(引用文献2)。基于此，牛羊乳外泌体作为一种相对稳定的生物活性物质，已成为当前研究热点之一。

2、现有的乳源外泌体分离方法主要有超速离心法、蔗糖密度梯度离心法、商业试剂盒提取法及尺寸排阻色谱法，其中，超速离心法是乳源外泌体提取的“金标准”方法。然而，由于牛乳样本成分复杂，其中含有与牛乳外泌体粒径接近的乳脂肪球(0.1-15μm)(引用文献3、引用文献4)。此外牛乳中还含有与外泌体粒径和密度接近的酪蛋白胶束，其粒径和密度大小分别为100-500nm、1.0632g/ml(引用文献5)，在提取牛乳外泌体的过程中存在上述成分与乳源外泌体共分离导致外泌体污染的风险，从而很难获得纯净且单一的外泌体样品。因此，必须对分离出的样品进行鉴定，确认其是否为外泌体样本。

3、现有的分离得到的外泌体样品通常需要从形态、大小及表面标志性蛋白三个方面共同鉴定。通过电镜成像，如扫描电子显微镜(sem)和透射电子显微镜(tem)等，观察粒子形态，用于鉴定外泌体的存在和完整性；利用纳米粒子跟踪分析(nta)与动态光散射法(dls)测量外泌体浓度与大小分布；通过蛋白质免疫印迹技术(wb)、酶联免疫(elisa)以及流式细胞技术(fcm)等，鉴定外泌体表面标志性蛋白，如cd9、cd63、tsg101等。基于上述三方面的共同表征结果才能确定分离样品为外泌体以及外泌体的数量和完整性，导致整个外泌体鉴定方法存在操作复杂、成本较高的局限性。

4、引用文献：

5、引用文献1：kimiz-gebologlu i,oncel ss.exosomes:large-scale production,isolation,drug loading efficiency,and biodistribution and uptake.jcontrolrelease.2022jul；347:533-543.

6、引用文献2：mittelbrunn m,gutiérrez-vázquez c,villarroya-beltri c,gonzález s,sánchez-cabo f,gonzález,bernad a,sánchez-madrid f.unidirectionaltransfer of microrna-loaded exosomes from t cells to antigen-presentingcells.nat commun.2011；2:282.

7、引用文献3：mather ih,keenan tw.origin and secretion of milklipids.jmammary gland biol neoplasia.1998jul；3(3):259-73.

8、引用文献4：mcmahon dj,oommen bs.supramolecular structure of the caseinmicelle.j dairy sci.2008may；91(5):1709-21.

9、引用文献5：klostermeyer h,humbel re.the chemistry and biochemistry ofinsulin.angew chem int ed engl.1966sep；5(9):807-22.

技术实现思路

1、发明要解决的问题

2、由于动物乳成分复杂，通过本领域常规的分离方法在提取乳外泌体时，乳中其他成分例如各种乳蛋白等有可能随乳外泌体一同被分离，因此需要对分离获得的乳外泌体样品进行鉴定。

3、然而，现有的乳源外泌体的分离鉴定方法通常包括对形态、大小及表面标志性蛋白等多方面的考察，存在操作繁琐、前处理复杂、耗时，成本高昂等方面的不足。

4、对此，本发明旨在提供一种基于琼脂糖凝胶电泳的简便、快速、低成本、普适性强的乳源外泌体的鉴定和提取方法。

5、用于解决问题的方案

6、本发明发现，可以通过以下技术方案来解决上述技术问题：

7、[1].一种乳源外泌体的鉴定方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

8、样品处理的步骤：将乳源外泌体样品与荧光标记染料混合，以得到荧光染料标记的待测样品；

9、对照品处理的步骤：将乳源外泌体标准品与荧光标记染料混合，以得到荧光染料标记的待测标准品；

10、琼脂糖凝胶电泳的步骤：对所述待测样品和所述待测标准品进行琼脂糖凝胶电泳；和

11、检测的步骤：通过蓝光透射获取电泳图谱并检测如下(i)～(iii)中的任意一项或多项：

12、(i)在所述待测样品的电泳图谱中，是否存在与所述待测标准品的电泳图谱中的乳源外泌体的条带位置相同的条带；

13、(ii)在所述待测样品的电泳图谱中，是否存在单一的乳源外泌体的条带；

14、(iii)在所述待测样品的电泳图谱中，乳源外泌体的条带的灰度值。

15、[2].根据[1]所述的鉴定方法，其特征在于，所述乳源外泌体样品通过如下方法获取：以动物乳为原料，去除乳脂后任选地通过凝乳酶处理或等电点沉淀处理去除至少部分酪蛋白，随后通过超速离心处理沉淀乳源外泌体，并重悬于液体介质中，即得。

16、[3].根据[1]或[2]所述的鉴定方法，其特征在于，所述荧光标记染料选自chromeop503染料、pkh67染料、bodipy fl l-cystine染料、alexa fluor 488染料和fitc染料中的任意一种。

17、[4].根据[1]～[3]中任一项所述的鉴定方法，其特征在于，所述荧光标记染料的工作浓度为0.005～0.05mg/ml。

18、[5].根据[1]～[4]中任一项所述的鉴定方法，其特征在于，所述琼脂糖凝胶的浓度为0.3g/100ml～2g/100ml。

19、[6].根据[1]～[5]中任一项所述的鉴定方法，其特征在于，所述琼脂糖凝胶电泳中使用的电泳缓冲液的ph值为7～12。

20、[7].根据[1]～[6]中任一项所述的鉴定方法，其特征在于，所述琼脂糖凝胶电泳的电压为80～100v，电泳的时间为20～40min。

21、[8].一种乳源外泌体的提取方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

22、样品处理的步骤：将乳源外泌体样品与荧光标记染料混合，以得到含有荧光染料标记的乳源外泌体的样品i；

23、琼脂糖凝胶电泳的步骤：对所述样品i进行琼脂糖凝胶电泳；和

24、乳源外泌体提取的步骤：通过蓝光透射确定乳源外泌体条带所在位置，并对该位置处的琼脂糖凝胶进行切割以获得凝胶块i，将所述凝胶块i置于tae缓冲液中并进行电泳，以获得含有乳源外泌体的tae缓冲液，对所述含有乳源外泌体的tae缓冲液进行超滤，以收集乳源外泌体。

25、[9].根据[8]所述的提取方法，其特征在于，所述乳源外泌体样品通过如下方法获取：以动物乳为原料，去除乳脂后任选地通过凝乳酶处理或等电点沉淀处理去除至少部分酪蛋白，随后通过超速离心处理沉淀乳源外泌体，并重悬于液体介质中，即得。

26、[10].根据[8]或[9]所述的提取方法，其特征在于，所述荧光标记染料选自chromeo p503染料、pkh67染料、bodipy fl l-cystine染料、alexa fluor488染料和fitc染料中的任意一种。

27、[11].根据[8]～[10]中任一项所述的提取方法，其特征在于，所述荧光标记染料的工作浓度为0.005～0.05mg/ml。

28、[12].根据[8]～[11]中任一项所述的提取方法，其特征在于，所述琼脂糖凝胶的浓度为0.3g/100ml～2g/100ml。

29、[13].根据[8]～[13]中任一项所述的提取方法，其特征在于，所述琼脂糖凝胶电泳中使用的电泳缓冲液的ph值为7～12。

30、[14].根据[8]～[13]中任一项所述的提取方法，其特征在于，所述琼脂糖凝胶电泳的电压为80～100v，电泳的时间为20～40min。

31、[15].根据[8]～[14]中任一项所述的提取方法，其特征在于，在所述乳源外泌体提取的步骤中，所述电泳的电压为90～110v，电泳的时间为50～70min。

32、发明的效果

33、本发明基于琼脂糖凝胶电泳提供了乳外泌体的快速鉴定方法。本发明发现，在琼脂糖凝胶电泳过程中，尤其是在适当的琼脂糖凝胶浓度以及电泳缓冲液ph的条件下，乳源外泌体与在常规乳源外泌体提取工艺中可能随乳源外泌体一并分离得到的例如乳蛋白等物质具有不同的迁移率，从而可以实现有效分离，进而可以实现乳源外泌体的纯度、含量等的快速表征。进一步，通过对乳源外泌体琼脂糖凝胶电泳条带的切割回收，可以实现乳源外泌体的提取。

34、本发明提供的鉴定和提取方法无需进行例如nta、wb、tem等多个方面的鉴定，仅需琼脂糖凝胶电泳即可实现乳源外泌体的鉴定与提取，整体操作快速、简便、高通量。此外，本发明提供的鉴定和提取方法的准确性较高，普适性强，可适用于超速离心法、凝乳酶处理结合超速离心法、等电点沉淀处理结合超速离心法等多种分离方式下获得的样品中乳源外泌体的鉴定表征，具有广泛的市场应用潜力。