猪甲型流感病毒疫苗的制作方法

本发明涉及编码一种或多种甲型流感病毒神经氨酸酶(na)抗原的载体和/或核酸构建体。本发明还涉及包含这些载体和/或核酸构建体的针对甲型流感病毒的疫苗。本发明还涉及单独或与其他保护剂组合制备和使用所述疫苗的方法。

背景技术：

1、甲型流感病毒(iav)给全世界的人类和动物健康带来了沉重负担。iav是正粘病毒(orthomyyxoviridae)科成员，基于其病毒表面糖蛋白血凝素(ha)和神经氨酸酶(na)将其分为不同亚型。iav感染家禽、猪、马、猫、犬、海洋哺乳动物(例如，鲸)、蝙蝠和人类。野生水禽和岸禽(鸭、鹅、天鹅和海鸥)是天然储库，其可以被16种不同ha和9种不同na亚型感染[webster等，microbiol rev 56：152-179(1992)]。最近，在蝙蝠中鉴定出两种新亚型h17n10和h18n11[tong等，proc.natl.acad.sci.109(11)：4269-4274(2012)和mehle，viruses 6(9)：3438-3449(2014)]。病毒的种间传播最常见于野生和家养水禽之间以及猪与人之间[nelson和vincent，23(3)trends in microbiol.142-153(2015)]。感染iav的哺乳动物显示出急性呼吸道疾病，导致气溶胶病毒传播。在水禽和家禽中，病毒可以在呼吸道和肠道中复制，并通过粪-口途径传播。

2、一种此类iav猪甲型流感病毒(iav-s)是家猪的严重呼吸道病原体，已证明其在经济上是昂贵的，特别是对全世界畜牧业而言[holtkamp等，the american association ofswine veterinarians annual meeting(2007)]。此外，猪源性流感病毒向人类的传播已有充分记录，并构成了重大公共卫生威胁，因此，其提供了更大诱因来控制猪群中的甲型流感病毒[krueger和gray，curr top microbiol immunol 370：201-225(2013)]。

3、针对这一问题，很多养猪户现在使用可商购的疫苗为猪接种iav-s疫苗。然而，使用常规疫苗控制iav-s很困难，因为很多不同iav-s毒株在田野共同流行并且不断进化[gao等，j gen virol 98(8)：2001-2010(2017)]。iav-s的多样性和易变性是由病毒的遗传结构引起的。与其他甲型流感病毒一样，iav-s具有在8个rna区段上编码的基因和引入频繁突变的基因组复制机制。这些遗传特征使iav-s能够快速适应，包括避免存在因暴露于此前的毒株而诱发的中和抗体。因此，尽管包含多达5个不同iav-s毒株，但已证实在美国市场上可以买到的灭活病毒iav-s疫苗是不足的，因为由于持续的抗原漂移导致产生了新出现的毒株。

4、甲型流感病毒的分类从ha和na的亚型开始，其是病毒表面上的两种主要糖蛋白。ha蛋白介导病毒与宿主细胞的附着和融合。与ha结合的抗体可阻断：病毒附着、病毒复制并减少或甚至预防疾病。神经氨酸酶是一种在流感病毒复制周期的最后阶段起作用的酶，其通过从宿主细胞中裂解新形成的病毒颗粒，从而使新的子代病毒传播并感染其他细胞。与na结合的抗体限制其酶活性，从而可以降低某些动物模型中病毒的传播水平和疾病的严重程度。

5、尽管人甲型流感病毒通常在给定的流感季节在全球范围内传播1或2个优势株，但更多iav-s毒株同时共同传播，而这些毒株在地理区域之间也有所不同。iav-s毒株具有抗原可变性，但主要包含ha的h1或h3亚型，和na的n1或n2亚型。在iav-s的每个ha和na亚型中，都存在进一步的系统发生多样性。在美国猪群中，有四个主要的h1系统发生簇(phylogenetic cluster)(γ、δ1、δ2、大流行)、两个主要的h3簇(簇iv和人样)、两个主要的n1簇(经典、大流行)和两个主要的n2簇(n2-1998和n2-2002)。[参见，anderson等，influenza and other respiratory viruses 7(suppl.4)；42-51(2013)；和anderson等，msphere 1(6)e00275-16：1-14(2016)]。在欧洲，有三个主要h1谱系(欧亚禽类样h1、苏格兰/410440/1994-样h1和大流行2009样h1)、一个主要h3谱系(根特/1/1984-样h3)、两个主要n1谱系(欧亚禽类样n1、大流行2009样n1)、两个主要n2谱系(根特/1/1984-样n2、苏格兰/410440/1994-样n2)和两个次要n2谱系(意大利/4675/2003样n2、人季节样n2)[watson等，j.virol.，89：9920-9931(2015)；doi：10.1128/jvi.00840-15]。

6、多年来，已在疫苗中使用多种基于载体的策略，以努力针对某些病原体产生保护作用。一种这样的载体策略包括使用α病毒衍生的复制子rna颗粒(rp)[vander veen等，anim health res rev.13(1)：1-9.(2012)doi：10.1017/s1466252312000011；kamrud等，jgen virol.，91(pt 7)：1723-1727(2010)]，其是由几种不同α病毒开发而成，包括委内瑞拉马脑炎病毒(vee)[pushko等，virology 239：389-401(1997)]、辛德毕斯(sin)[bredenbeek等，journal of virology 67：6439-6446(1993)]和塞姆利基森林病毒(sfv)[liljestrom和garoff，biotechnology(ny)9：1356-1361(1991)]。rp疫苗可将繁殖缺陷的α病毒rna复制子递送到宿主细胞中，并在体内表达一种或多种所需的抗原转基因[pushko等，virology239(2)：389-401(1997)]。当与一些传统疫苗制剂比较时，rp具有有吸引力的安全性和功效性质[vander veen等，anim health res rev.13(1)：1-9.(2012)]。已将rp平台用于编码致病性抗原，并且其是几种usda许可的猪和家禽疫苗的基础。

7、如上所述，可用于家猪的市销iav-s疫苗通常无法保护畜群，因为这些抗原与田野传播的所有现代毒株均不匹配[lee等，can j vet res 71(3)：207-12(2007)；vincent等，vaccine 28(15)：2782-2787(2010)]。灭活病毒抗原的常规平台受到监管和生产因素的限制，这些因素限制了针对不断发展的病毒抗原漂移而快速更新疫苗株的响应能力。对于常规灭活病毒iav-s疫苗，病毒株的选择基于ha抗原性质。免疫应答的血清学评价类似地集中在测量针对ha的抗体。对ha抗原的相同强调也适用于市售的针对人类以及其他流感易感动物物种(例如，禽类、马、犬)的已上市灭活流感病毒疫苗。诱导ha抑制(hi)抗体效价的iav-s疫苗可保护猪免受抗原相似毒株的实验性感染[kyriakis等，vet microbiol 144(1-2)：67-74(2010)]。然而，ha基因相对迅速的遗传漂移使得出现了新毒株，其不受由疫苗诱导的ha抗体的功能性抑制。

8、临床研究表明，na特异性抗体效价与人类流感疾病发病率降低之间具有统计学上显著的相关性[memoli等，mbio 7(2)：e00417-16.(2016)；monto等，j infect dis 212(8)：1191-1199(2015)；murphy等，n engl j med 286(25)：1329-32(1972)]。在近交系小鼠中进行的各种研究表明，na特异性免疫可以防止攻击感染[brett和johansson，virology 339(2)：273-80(2005)；johansson和kilbourne，proc natl acad sci usa 91(6)：2358-2361(1994)；kilbourne等，j infect dis 189(3)：459-461(2004)]。hessel等[plos one 5(8)，e12217(2010)]发现，包含编码iav-s na的重组痘病毒载体的疫苗能够部分诱导小鼠免受病毒攻击，但痘病毒载体na的功效不及编码相应ha基因的等效疫苗。然而，重要的是，不能将利用小鼠的流感动物模型作为疫苗功效的可靠预测指标，因为与猪、禽类和人不同，小鼠不是甲型流感病毒的天然宿主[bodewes等，expert rev vaccines 9(1)：59-72(2010)；tripp和tompkins，curr top microbiol immunol 333：397-412(2009)；vander veen等，vaccine 30(11)：1944-1950(2012)]。事实上，必须首先使病毒株适应在小鼠中生长，因为该物种对甲型流感病毒感染天然不敏感。相应地，发病机制和疾病由体重减轻和死亡率表示，这与天然宿主的感染参数不同。

9、在鸡(流感病毒的天然宿主物种)中使用利用病毒载体的na疫苗抵抗攻击感染进行了类似研究。鸡的na免疫力仅能部分保护其免受感染，并且其显著不及由等效载体ha疫苗诱导的免疫力稳健[nayak等，j virol 84(5)：2408-2420(2010)；pavlova等，vaccine 27(5)：773-785(2009)；sylte等，vaccine 25(19)：3763-72(2007)]。在另一种自然易感的流感病毒宿主雪貂中报告了类似结果，向雪貂接种可溶性重组na和/或ha蛋白，随后进行病毒攻击[bosch等，j virol 84(19)：10366-103674(2010)]。这些数据在一起表明，na免疫力只能对更关键的ha免疫力起补充和/或互补作用。的确，似乎在没有血凝素抗原的情况下，神经氨酸酶甲型流感病毒疫苗的效力不足以保护免于甲型流感病毒感染或保护免于甲型流感病毒引起的疾病。

10、一项公开发表的研究检测了减毒伪狂犬病毒(prv)载体na疫苗在猪中对病毒攻击感染的影响[klingbeil等，virus res 199：20-30(2015)]。值得注意的是，prv-na与prv-ha的结合并未提供对由prv-ha本身诱导的保护作用的显著改善。研究数据确实表明，prv-na疫苗，无论是单独施用还是与prv-ha疫苗共同施用，均可诱导针对na蛋白的血清抗体。然而，尽管产生了抗体，但接种na的猪只表现出非常轻微的病毒复制程度降低(仅在一个取样日有统计学意义：感染后4天)。如所预期的那样，仅用prv-ha载体接种的猪可诱导hi抗体应答，但这些应答与病毒脱落更显著的减少相关(从感染后2-6天就开始具有统计学意义)。实际上，到目前为止，确实没有已发表的研究表明，在不存在相应血凝素抗原的情况下，包含和/或编码甲型流感病毒神经氨酸酶抗原的iav-s疫苗可以充分保护猪免受iav-s感染。

11、不应将本文引用的任何参考文献解释为承认该参考文献可作为本技术的“现有技术”。

技术实现思路

1、因此，本发明提供了编码一种或多种甲型流感病毒神经氨酸酶(na)抗原的载体和/或核酸构建体。可以将这些载体和/或核酸构建体用于包含这些载体的免疫原性组合物中。本发明的免疫原性组合物可以用于疫苗中，所述疫苗有助于保护接种的受试者(例如，人、伴侣动物或家畜)免于遭受甲型流感病毒感染，例如有助于预防甲型流感病毒感染。在特定实施方式中，本发明的免疫原性组合物和疫苗包含一种或多种na，所述na来源于甲型流感病毒，其既不包含流感病毒血凝素(ha)或其抗原性片段，也不包含编码甲型流感病毒ha或其抗原性片段的核苷酸序列。

2、在某些实施方式中，提供了编码一种或多种人甲型流感病毒na抗原的载体和/或核酸构建体。在其他实施方式中，载体和/或核酸构建体编码一种或多种犬流感病毒na抗原。在另外其他实施方式中，载体和/或核酸构建体编码一种或多种马流感病毒na抗原。在又一些其他实施方式中，载体和/或核酸构建体编码一种或多种禽类流感病毒na抗原。在另外其他实施方式中，载体和/或核酸构建体编码一种或多种牛流感病毒na抗原。在具体实施方式中，载体和/或核酸构建体编码两种至四种流感病毒na抗原。

3、在具体实施方式中，载体是α病毒rna复制子颗粒，其编码来源于甲型流感病毒的一种或多种抗原。在特定实施方式中，α病毒rna复制子颗粒编码一种或多种甲型流感病毒na。在相关实施方式中，α病毒rna复制子颗粒编码一种或多种甲型流感病毒na的一个或多个抗原性片段。本发明还包括其他载体和/或核酸构建体，其编码来源于猪甲型流感病毒(iav-s)的一种或多种抗原。在特定实施方式中，载体和/或核酸构建体还可以编码一种或多种iav-s神经氨酸酶抗原(na)。在相关实施方式中，载体和/或核酸构建体可以编码一种或多种na的一个或多个iav-s抗原性片段。

4、在本发明的一个重要方面中，提供了载体和/或核酸构建体，其编码一种或多种猪甲型流感病毒(iav-s)神经氨酸酶(na)抗原。此类载体和/或核酸构建体可以用于包含这些载体的免疫原性组合物中。本发明的免疫原性组合物可以用于疫苗中，所述疫苗有助于保护接种的猪受试者(例如，母猪和/或仔猪)免于遭受iav-s感染，例如有助于预防猪流感病毒感染。在特定实施方式中，免疫原性组合物和疫苗包含一种或多种na，所述na来源于本发明的iav-s，其既不包含iav-s ha或其抗原性片段，也不包含编码iav-s ha或其抗原性片段的核苷酸序列。本发明还提供了用于激发针对iav-s和其他疾病(例如，其他猪感染性疾病)的保护性免疫的组合疫苗。还提供了制备和使用本发明的免疫原性组合物和疫苗的方法。

5、在更具体的实施方式中，载体是α病毒rna复制子颗粒，其编码来源于iav-s的一种或多种抗原。在特定实施方式中，α病毒rna复制子颗粒编码一种或多种iav-s na。在相关实施方式中，α病毒rna复制子颗粒编码一种或多种iav-s na的一个或多个抗原性片段。在特定实施方式中，α病毒rna复制子颗粒编码一种或多种na，所述na来源于本发明的iav-s，其既不包含iav-s ha或其抗原性片段，也不包含编码iav-s ha或其抗原性片段的核苷酸序列。

6、在某些实施方式中，iav-s na来源于n1-经典系统发生簇。在其他实施方式中，α病毒rna复制子颗粒编码来源于n1-经典系统发生簇的na的抗原性片段。在另外其他实施方式中，iav-s na来源于n2-1998系统发生簇。在又一些其他实施方式中，α病毒rna复制子颗粒编码来源于n2-1998系统发生簇的na的抗原性片段。在另外其他实施方式中，iav-s na来源于n1-大流行系统发生簇。在又一些其他实施方式中，α病毒rna复制子颗粒编码来源于n1-大流行系统发生簇的na的抗原性片段。在另外其他实施方式中，iav-s na来源于n2-2002系统发生簇。在又一些其他实施方式中，α病毒rna复制子颗粒编码来源于n2-2002系统发生簇的na的抗原性片段。

7、在一个类似实施方式中，iav-s na来源于-和/或α病毒rna复制子颗粒编码来自n1-大流行(eu)谱系的na(或其抗原性片段)。在一个类似实施方式中，iav-s na来源于-和/或α病毒rna复制子颗粒编码来自n1-欧亚禽类谱系的na(或其抗原性片段)。

8、在一个类似实施方式中，iav-s na来源于-和/或α病毒rna复制子颗粒编码来自n2-根特/1984谱系的na(或其抗原性片段)。在另一个类似实施方式中，iav-s na来源于-和/或α病毒rna复制子颗粒编码来自n2-意大利/2003谱系的na(或其抗原性片段)。在又一个类似实施方式中，iav-s na来源于-和/或α病毒rna复制子颗粒编码来自n2-苏格兰/1994谱系的na(或其抗原性片段)。在这种类型的某些实施方式中，iav-s na来源于-和/或α病毒rna复制子颗粒编码来自n2-苏格兰/1994谱系(分支1)的na(或其抗原性片段)。在这种类型的其他实施方式中，iav-s na来源于-和/或α病毒rna复制子颗粒编码来自n2-苏格兰/1994谱系(分支2)的na(或其抗原性片段)。在这种类型另外的其他实施方式中，iav-sna来源于-和/或α病毒rna复制子颗粒编码来自a/猪/意大利/4675/2003样n2的na(或其抗原性片段)。在这种类型另外的其他实施方式中，iav-s na来源于-和/或α病毒rna复制子颗粒编码来自人季节样n2的na(或其抗原性片段)。

9、在特定实施方式中，来源于n1-经典系统发生簇的iav-s na包含与seq id no：2所示的氨基酸序列具有95％同一性、97％同一性、98％同一性或更高同一性的氨基酸序列。在这种类型更具体的实施方式中，na包含seq id no：2所示的氨基酸序列。在这种类型甚至更具体的实施方式中，na由seq id no：1所示的核苷酸序列编码。在其他实施方式中，来源于n1-大流行系统发生簇的iav-s na包含与seq id no：4所示的氨基酸序列具有95％同一性、97％同一性、98％同一性或更高同一性的氨基酸序列。在这种类型更具体的实施方式中，na包含seq id no：4所示的氨基酸序列。在这种类型甚至更具体的实施方式中，na由seq idno：3所示的核苷酸序列编码。在又一些其他实施方式中，来源于n2-1998系统发生簇的iav-s na包含与seq id no：6所示的氨基酸序列具有92％同一性、94％同一性、97％同一性或更高同一性的氨基酸序列。在这种类型更具体的实施方式中，na包含seq id no：6所示的氨基酸序列。在这种类型甚至更具体的实施方式中，na由seq id no：5所示的核苷酸序列编码。在又一些其他实施方式中，来源于n2-2002系统发生簇的iav-s na包含与seq id no：8所示的氨基酸序列具有92％同一性、94％同一性、97％同一性或更高同一性的氨基酸序列。在这种类型更具体的实施方式中，na包含seq id no：8所示的氨基酸序列。在这种类型甚至更具体的实施方式中，na由seq id no：7所示的核苷酸序列编码。

10、在特定实施方式中，来源于n1-大流行(eu)谱系的iav-s na包含与seq id no：12所示的氨基酸序列具有90％同一性、92％同一性、95％同一性或更高同一性的氨基酸序列。在这种类型更具体的实施方式中，na包含seq id no：12所示的氨基酸序列。在这种类型甚至更具体的实施方式中，na由seq id no：12所示的核苷酸序列编码。在这种类型的相关实施方式中，na由seq id no：23所示的核苷酸序列编码。在其他实施方式中，来源于n1-欧亚禽类谱系的iav-s na包含与seq id no：14所示的氨基酸序列具有85％同一性、90％同一性、95％同一性或更高同一性的氨基酸序列。在这种类型更具体的实施方式中，na包含seqid no：14所示的氨基酸序列。在这种类型甚至更具体的实施方式中，na由seq id no：13所示的核苷酸序列编码。在又一些其他实施方式中，来源于n2-根特/1984谱系的iav-s na包含与seq id no：16所示的氨基酸序列具有90％同一性、92％同一性、95％同一性或更高同一性的氨基酸序列。在这种类型更具体的实施方式中，na包含seq id no：16所示的氨基酸序列。在这种类型甚至更具体的实施方式中，na由seq id no：15所示的核苷酸序列编码。在这种类型的相关实施方式中，na由seq id no：24所示的核苷酸序列编码。在又一些其他实施方式中，来源于n2-意大利/2003谱系的iav-s na包含与seq id no：18所示的氨基酸序列具有90％同一性、92％同一性、95％同一性或更高同一性的氨基酸序列。在这种类型更具体的实施方式中，na包含seq id no：18所示的氨基酸序列。在这种类型甚至更具体的实施方式中，na由seq id no：17所示的核苷酸序列编码。在这种类型的相关实施方式中，na由seqid no：25所示的核苷酸序列编码。在其他实施方式中，来源于n2-苏格兰/1994(分支1)谱系的iav-s na包含与seq id no：20所示的氨基酸序列具有90％同一性、92％同一性、95％同一性或更高同一性的氨基酸序列。在这种类型更具体的实施方式中，na包含seq id no：20所示的氨基酸序列。在这种类型甚至更具体的实施方式中，na由seq id no：19所示的核苷酸序列编码。在这种类型的相关实施方式中，na由seq id no：26所示的核苷酸序列编码。在又一些其他实施方式中，来源于n2-苏格兰/1994(分支2)谱系的iav-s na包含与seq idno：22所示的氨基酸序列具有90％同一性、92％同一性、95％同一性或更高同一性的氨基酸序列。在这种类型更具体的实施方式中，na包含seq id no：22所示的氨基酸序列。在这种类型甚至更具体的实施方式中，na由seq id no：21所示的核苷酸序列编码。在这种类型的相关实施方式中，na由seq id no：27所示的核苷酸序列编码。

11、在另外更特定的实施方式中，α病毒rna复制子颗粒是委内瑞拉马脑炎(vee)α病毒rna复制子颗粒。在另外更具体的实施方式中，vee α病毒rna复制子颗粒是tc-83vee α病毒rna复制子颗粒。在其他实施方式中，α病毒rna复制子颗粒是辛德毕斯(sin)α病毒rna复制子颗粒。在另外其他实施方式中，α病毒rna复制子颗粒是塞姆利基森林病毒(sfv)α病毒rna复制子颗粒。在一个替代实施方式中，裸dna载体包含核酸构建体，其编码来源于猪病原体的一种或多种抗原。在这种类型的特定实施方式中，裸dna载体包含核酸构建体，其编码来源于iav-s的na或其抗原性片段。在另外其他实施方式中，裸rna载体包含核酸构建体，其编码来源于猪病原体的一种或多种抗原。在这种类型的特定实施方式中，裸rna载体包含核酸构建体，其编码来源于iav-s的na或其抗原性片段。

12、本发明提供了α病毒rna复制子颗粒，其编码两种或更多种iav-s抗原或其抗原性片段。在特定实施方式中，α病毒rna复制子颗粒编码一种或多种na，所述na来源于本发明的iav-s，其既不包含iav-s ha或其抗原性片段，也不包含编码iav-s ha或其抗原性片段的核苷酸序列。

13、在具体实施方式中，α病毒rna复制子颗粒编码两种至四种或更多种来源于iav-s的na抗原或其抗原性片段。在相关实施方式中，α病毒rna复制子颗粒编码两种至四种或更多种来源于不同iav-s系统发生簇的na抗原或其抗原性片段。在某些实施方式中，α病毒rna复制子颗粒编码来源于n1-经典系统发生簇的na或其抗原性片段和来源于n2-2002系统发生簇的na或其抗原性片段。在其他实施方式中，α病毒rna复制子颗粒编码来源于n1-经典系统发生簇的na或其抗原性片段和来源于n2-1998系统发生簇的na或其抗原性片段。在另外其他实施方式中，α病毒rna复制子颗粒编码来源于n1-经典系统发生簇的na或其抗原性片段和来源于n1-大流行系统发生簇的na或其抗原性片段。

14、在某些实施方式中，α病毒rna复制子颗粒编码来源于n1-大流行(eu)谱系的na或其抗原性片段和来源于n1-欧亚禽类谱系的na或其抗原性片段。在其他实施方式中，α病毒rna复制子颗粒编码来源于n2-根特/1984谱系的na或其抗原性片段和来源于n2-意大利/2003谱系的na或其抗原性片段。在另外其他实施方式中，α病毒rna复制子颗粒编码来源于n2-根特/1984谱系的na或其抗原性片段和来源于n2-苏格兰/1994(分支1)谱系的na或其抗原性片段。在另外其他实施方式中，α病毒rna复制子颗粒编码来源于n2-根特/1984谱系的na或其抗原性片段和来源于n2-苏格兰/1994(分支2)谱系的na或其抗原性片段。在另外其他实施方式中，α病毒rna复制子颗粒编码来源于n2-意大利/2003谱系的na或其抗原性片段和来源于n2-苏格兰/1994(分支1)谱系的na或其抗原性片段。在另外其他实施方式中，α病毒rna复制子颗粒编码来源于n2-意大利/2003谱系的na或其抗原性片段和来源于n2-苏格兰/1994(分支2)谱系的na或其抗原性片段。在另外其他实施方式中，来源于欧洲n1谱系之一的na或其抗原性片段与来源于欧洲n2谱系之一的na或其抗原性片段一起在α病毒rna复制子颗粒中编码。类似地，本发明包括编码三种、四种或更多种na的α病毒rna复制子颗粒，每种na来源于不同欧洲谱系。此外，本发明包括编码两种、三种、四种或更多种na的α病毒rna复制子颗粒，每种na来源于不同欧洲谱系和/或系统发生簇。

15、因此，本发明还提供了α病毒rna复制子颗粒，其编码三种或四种iav-s抗原或其抗原性片段。在具体实施方式中，免疫原性组合物包含α病毒rna复制子颗粒，其编码三种或四种来源于iav-s的na抗原或其抗原性片段。在相关实施方式中，免疫原性组合物包含α病毒rna复制子颗粒，其编码三种或四种来源于不同iav-s系统发生簇的na抗原或其抗原性片段。在某些实施方式中，α病毒rna复制子颗粒编码来源于n1-经典系统发生簇的na或其抗原性片段、来源于n2-2002系统发生簇的na或其抗原性片段和来源于n2-1998系统发生簇的na或其抗原性片段。在其他实施方式中，α病毒rna复制子颗粒编码来源于n1-经典系统发生簇的na或其抗原性片段、来源于n2-2002系统发生簇的na或其抗原性片段和来源于n1-大流行系统发生簇的na或其抗原性片段。在其他实施方式中，α病毒rna复制子颗粒编码来源于n1-经典系统发生簇的na或其抗原性片段、来源于n2-1998系统发生簇的na或其抗原性片段和来源于n1-大流行系统发生簇的na或其抗原性片段。在其他实施方式中，α病毒rna复制子颗粒编码来源于n2-2002系统发生簇的na或其抗原性片段、来源于n2-1998系统发生簇的na或其抗原性片段和来源于n1-大流行系统发生簇的na或其抗原性片段。

16、在具体实施方式中，α病毒rna复制子颗粒编码四种或更多种iav-s na抗原或其抗原性片段。在更具体的实施方式中，α病毒rna复制子颗粒编码四种或更多种来源于不同iav-s系统发生簇的na抗原或其抗原性片段。在甚至更具体的实施方式中，α病毒rna复制子颗粒编码来源于n2-2002系统发生簇的na或其抗原性片段、来源于n2-1998系统发生簇的na或其抗原性片段、来源于n1-大流行系统发生簇的na或其抗原性片段和来源于n1-经典系统发生簇的na或其抗原性片段。

17、在如上所述的类似实施方式中，α病毒rna复制子颗粒编码三种、四种或更多种iav-s na抗原或其抗原性片段，其来源于iav-s n1-大流行(eu)谱系、n1-欧亚禽类谱系、na谱系、n2-根特/1984谱系、n2-意大利/2003谱系、n2-苏格兰/1994(分支1)谱系和/或n2-苏格兰/1994(分支2)谱系。

18、如上所述，本发明的所有α病毒rna复制子颗粒可以是免疫原性组合物和/或疫苗的组分。因此，本发明的免疫原性组合物和/或疫苗可以包含一种或多种本发明的α病毒rna复制子颗粒。在某些实施方式中，免疫原性组合物和/或疫苗仅包含一组相同的α病毒rna复制子颗粒，其可以编码一种或多种来源于一种或多种系统发生簇和/或一种或多种谱系的na，如上文所详述的。

19、在这种类型一个更具体的实施方式中，免疫原性组合物和/或疫苗包含rna复制子颗粒，其编码来源于n1-系统发生簇的na(或其抗原性片段)和来源于n2-系统发生簇的na(或其抗原性片段)两者。特别地，免疫原性组合物和/或疫苗包含rna复制子，其中第一na是属于选自n1-经典和n1-大流行系统发生簇的n1-系统发生簇和第二na是属于选自n2-1998和n2-2002系统发生簇的n2-系统发生簇。

20、在这种类型更特定的实施方式中，免疫原性组合物和/或疫苗包含rna复制子，其中第一na是属于选自n1-大流行(eu)和n1-欧亚禽类谱系的n1-谱系和第二na是属于选自n2-根特/1984、n2-意大利/2003、n2-苏格兰1994(分支1)谱系和n2-苏格兰1994(分支2)谱系的n2-系统发生谱系。

21、本发明还提供了免疫原性组合物和/或疫苗，其包含两组或更多组此类α病毒rna复制子颗粒。在这种类型的特定实施方式中，一组α病毒rna复制子颗粒编码一种或多种来源于一个系统发生簇和/或谱系的na，而另一组α病毒rna复制子颗粒编码一种或多种来源于另一个系统发生簇和/或谱系的na。

22、在这种类型的具体实施方式中，第一组α病毒rna复制子颗粒编码一种或多种来源于n1-系统发生簇和/或谱系的na抗原或其抗原性片段，和第二组α病毒rna复制子颗粒编码一种或多种来源于n2-系统发生簇和/或谱系的na抗原或其抗原性片段。特别地，在第一组中，na抗原(或其片段)是属于选自n1-经典和n1-大流行系统发生簇的n1-系统发生簇，在第二组中，na抗原(或其抗原性片段)是属于选自n2-1998和n2-2002系统发生簇的n2-系统发生簇。

23、在类似、平行的实施方式中，在第一组中，na抗原(或其片段)是属于选自n1-大流行(eu)和n1-欧亚禽类谱系的n1-系统发生谱系，在第二组中，na抗原(或其抗原性片段)是属于选自n2-根特/1984、n2-意大利/2003、n2-苏格兰1994(分支1)谱系和n2-苏格兰1994(分支2)谱系的n2-谱系。

24、在又一些其他实施方式中，免疫原性组合物和/或疫苗包含编码第一抗原的一组α病毒rna复制子颗粒，编码第二抗原的另一组α病毒rna复制子颗粒和编码第三抗原的第三组α病毒rna复制子颗粒。更具体地，在免疫原性组合物和/或疫苗中，抗原是选自下组的系统发生簇的na抗原：n1-经典、n1-大流行、n2-1998和n2-2002系统发生簇，或者其是选自下组的谱系的na抗原：n1-大流行(eu)、n1-欧亚禽类、n2-根特/1984、n2-意大利/2003、n2-苏格兰1994(分支1)谱系和n2-苏格兰1994(分支2)谱系。

25、在这种类型的特定实施方式中，第一组α病毒rna复制子颗粒编码来源于n1经典系统发生簇的na或其抗原性片段；第二组α病毒rna复制子颗粒编码来源于n2-2002系统发生簇的na或其抗原性片段；和第三组α病毒rna复制子颗粒编码来源于n2-1998系统发生簇的na或其抗原性片段。

26、在又一些其他实施方式中，免疫原性组合物和/或疫苗包含编码第一抗原的一组α病毒rna复制子颗粒，编码第二抗原的另一组α病毒rna复制子颗粒，编码第三抗原的第三组α病毒rna复制子颗粒和编码第四抗原的第四组α病毒rna复制子颗粒。

27、更具体地，在免疫原性组合物和/或疫苗中，抗原是选自下组的系统发生簇的na抗原：n1-经典系统发生簇、n1-大流行系统发生簇、n2-1998系统发生簇和n2-2002系统发生簇，或者其是选自下组的谱系的na抗原：n1-大流行(eu)谱系、n1-欧亚禽类谱系、n2-根特/1984谱系、n2-意大利/2003谱系、n2-苏格兰1994(分支1)谱系和n2-苏格兰1994(分支2)谱系。

28、在这种类型的特定实施方式中，第一组α病毒rna复制子颗粒编码来源于n1-经典系统发生簇的na或其抗原性片段；第二组α病毒rna复制子颗粒编码来源于n2-2002系统发生簇的na或其抗原性片段；第三组α病毒rna复制子颗粒编码来源于n2-1998系统发生簇的na或其抗原性片段；和第四组α病毒rna复制子颗粒编码来源于n1-大流行系统发生簇的na或其抗原性片段。

29、因此，在本发明的一个方面中，免疫原性组合物/疫苗包含多组(例如，2-10组)α病毒rna复制子颗粒。在这种类型的特定实施方式中，一组或多组包含α病毒rna复制子颗粒，其编码一种或多种来源于一个或多个系统发生簇(或其抗原性片段)或谱系(或其抗原性片段)的iav-s na。在这种类型的具体实施方式中，免疫原性组合物包含一组或多组α病毒rna复制子颗粒，其编码一种或多种来源于一个或多个系统发生簇(或其抗原性片段)或谱系(或其抗原性片段)的iav-s na，联合一组或多组α病毒rna复制子颗粒，其编码一种或多种非-iav-s抗原或其抗原性片段。在甚至更具体的实施方式中，一组或多组α病毒rna复制子颗粒编码一种或多种来源于一个或多个系统发生簇(或其抗原性片段)或谱系(或其抗原性片段)的iav-s na和编码一种或多种非-iav-s抗原或其抗原性片段。在这种类型的具体实施方式中，α病毒rna复制子颗粒编码来源于n1-经典系统发生簇的na或其抗原性片段和/或来源于n2-2002系统发生簇的na或其抗原性片段，以及一种至三种非-iav-s抗原或其抗原性片段。

30、在特定实施方式中，非-iav-s抗原来源于猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrs)。在其他实施方式中，非-iav-s抗原来源于猪圆环病毒(pcv)。在另外其他实施方式中，非-iav-s抗原来源于可传播的胃肠炎病毒(tge)。在又一些其他实施方式中，非-iav-s抗原来源于猪伪狂犬病毒(pprv)。在另外其他实施方式中，非-iav-s抗原来源于猪细小病毒(ppv)。在又一些其他实施方式中，非-iav-s抗原来源于猪轮状病毒(prv)。在另外其他实施方式中，非-iav-s抗原来源于猪流行性腹泻病毒(ped)。在又一些其他实施方式中，一种或多种非-iav-s抗原来源于多杀性巴氏杆菌(pasteurella multocida)的一个或多个血清型。在另外其他实施方式中，一种或多种非-iav-s抗原来源于沙门氏菌属种(salmonella ssp)的一个或多个血清型。在又一些其他实施方式中，一种或多种非-iav-s抗原来源于大肠杆菌的一个或多个血清型。在另外其他实施方式中，一种或多种非-iav-s抗原来源于副猪嗜血杆菌(haemophilus parasuis)的一个或多个血清型。在又一些其他实施方式中，非-iav-s抗原来源于胞内劳森菌(lawsonia intracellularis)。在另外其他实施方式中，非-iav-s抗原来源于支原体属种(mycoplasma ssp)(例如，猪肺炎支原体(mycoplasmahyopneumoniae))。在又一些其他实施方式中，非-iav-s抗原来源于支气管败血波氏杆菌(bordetellabronchiseptica)。在另外其他实施方式中，非-iav-s抗原来源于丹毒菌属种(erysipelasssp)。在又一些其他实施方式中，非-iav-s抗原来源于弯曲杆菌属种(campylobacterssp)。在另外其他实施方式中，非-iav-s抗原来源于胸膜肺炎放线杆菌(actinobacilluspleuropneumoniae)。在又一些其他实施方式中，非-iav-s抗原来源于产气荚膜梭菌(clostridium perfringens)。在另外其他实施方式中，非-iav-s抗原来源于艰难梭菌(clostridium difficile)。

31、在更特定的实施方式中，α病毒rna复制子颗粒是委内瑞拉马脑炎(vee)α病毒rna复制子颗粒。在另外更具体的实施方式中，vee α病毒rna复制子颗粒是tc-83vee α病毒rna复制子颗粒。

32、本发明还提供了联合免疫原性组合物和/或疫苗(多价疫苗)，其包含编码一种或多种来源于iav-s的na或其抗原性片段的α病毒rna复制子颗粒，如上所述，以及还包含一种或多种经修饰的活/减毒或灭活猪病原体。在特定实施方式中，免疫原性组合物还包含一种或多种经修饰的活/减毒和/或灭活prrs病毒。在其他实施方式中，免疫原性组合物还包含一种或多种经修饰的活/减毒和/或灭活pcv。在又一些其他实施方式中，免疫原性组合物还包含一种或多种经修饰的活/减毒和/或灭活tge。在另外其他实施方式中，免疫原性组合物还包含一种或多种经修饰的活/减毒和/或灭活pprv。在又一些其他实施方式中，免疫原性组合物还包含一种或多种经修饰的活/减毒和/或灭活ppv。在另外其他实施方式中，免疫原性组合物还包含一种或多种经修饰的活/减毒和/或灭活prv。在又一些其他实施方式中，免疫原性组合物还包含一种或多种经修饰的活/减毒和/或灭活ped。在另外其他实施方式中，免疫原性组合物还包含一种或多种经修饰的活/减毒和/或灭活多杀性巴氏杆菌的血清型。在又一些其他实施方式中，免疫原性组合物还包含一种或多种经修饰的活/减毒和/或灭活沙门氏菌属种的血清型。在另外其他实施方式中，免疫原性组合物还包含一种或多种经修饰的活/减毒和/或灭活大肠杆菌的血清型。在又一些其他实施方式中，免疫原性组合物还包含一种或多种经修饰的活/减毒和/或灭活副猪嗜血杆菌。在另外其他实施方式中，免疫原性组合物还包含一种或多种经修饰的活/减毒和/或灭活胞内劳森菌。在又一些其他实施方式中，免疫原性组合物还包含一种或多种经修饰的活/减毒和/或灭活支原体属种(例如，猪肺炎支原体)。在另外其他实施方式中，免疫原性组合物还包含一种或多种经修饰的活/减毒和/或灭活支气管败血波氏杆菌。在又一些其他实施方式中，免疫原性组合物还包含一种或多种经修饰的活/减毒和/或灭活丹毒菌属种。在另外其他实施方式中，免疫原性组合物还包含一种或多种经修饰的活/减毒和/或灭活弯曲杆菌属种。在又一些其他实施方式中，免疫原性组合物还包含一种或多种经修饰的活/减毒和/或灭活胸膜肺炎放线杆菌。在另外其他实施方式中，免疫原性组合物还包含一种或多种经修饰的活/减毒和/或灭活产气荚膜梭菌。在又一些其他实施方式中，免疫原性组合物还包含一种或多种经修饰的活/减毒和/或灭活艰难梭菌。

33、在特定实施方式中，本发明的核酸构建体编码一种或多种来源于iav-s系统发生簇的na或其抗原性片段。因此，尽管下面具体示例了α病毒rna复制子颗粒，但是应当理解的是，本发明还包括其他载体和/或核酸构建体。

34、因此，在某些实施方式中，核酸构建体编码来源于n1-经典系统发生簇的iav-sna。在其他实施方式中，核酸构建体编码来源于n1-经典系统发生簇的na的抗原性片段。在另外其他实施方式中，iav-s na来源于n2-1998系统发生簇。在又一些其他实施方式中，α病毒rna复制子颗粒编码来源于n2-1998系统发生簇的na的抗原性片段。在另外其他实施方式中，iav-s na来源于n1-大流行系统发生簇。在又一些其他实施方式中，α病毒rna复制子颗粒编码来源于n1-大流行系统发生簇的na的抗原性片段。在另外其他实施方式中，iav-s na来源于n2-2002系统发生簇。在又一些其他实施方式中，核酸构建体编码来源于n2-2002系统发生簇的na的抗原性片段。

35、在一个类似实施方式中，iav-s na来源于来自n1-大流行(eu)谱系的na。在一个类似实施方式中，iav-s na来源于来自n1-欧亚禽类谱系的na。在一个类似实施方式中，iav-sna来源于来自n2-根特/1984谱系的na。在另一个类似实施方式中，iav-s na来源于n2-意大利/2003谱系。在又一个类似实施方式中，iav-s na来源于n2-苏格兰/1994谱系。在这种类型的某些实施方式中，iav-s na来源于n2-苏格兰/1994谱系(分支1)。在这种类型的其他实施方式中，iav-s na来源于n2-苏格兰/1994谱系(分支2)。

36、在特定实施方式中，来源于n1-经典系统发生簇的iav-s na包含与seq id no：2所示的氨基酸序列具有95％同一性、97％同一性、98％同一性或更高同一性的氨基酸序列。在这种类型更具体的实施方式中，na包含seq id no：2所示的氨基酸序列。在其他实施方式中，来源于n1-大流行系统发生簇的iav-s na包含与seq id no：4所示的氨基酸序列具有95％同一性、97％同一性、98％同一性或更高同一性的氨基酸序列。这种类型更具体的实施方式中，na包含seq id no：4所示的氨基酸序列。在又一些其他实施方式中，来源于n2-1998系统发生簇的iav-s na包含与seq id no：6所示的氨基酸序列具有92％同一性、94％同一性、97％同一性或更高同一性的氨基酸序列。在这种类型更具体的实施方式中，na包含seqid no：6所示的氨基酸序列。在又一些其他实施方式中，来源于n2-2002系统发生簇的iav-sna包含与seq id no：8所示的氨基酸序列具有92％同一性、94％同一性、97％同一性或更高同一性的氨基酸序列。在这种类型更具体的实施方式中，na包含seq id no：8所示的氨基酸序列。

37、在特定实施方式中，来源于n1-大流行(eu)谱系的iav-s na包含与seq id no：12所示的氨基酸序列具有90％同一性、92％同一性、95％同一性或更高同一性的氨基酸序列。在这种类型更具体的实施方式中，na包含seq id no：12所示的氨基酸序列。在其他实施方式中，来源于n1-欧亚禽类谱系的iav-s na包含与seq id no：14所示的氨基酸序列具有85％同一性、90％同一性、95％同一性或更高同一性的氨基酸序列。在这种类型更具体的实施方式中，na包含seq id no：14所示的氨基酸序列。在又一些其他实施方式中，来源于n2-根特/1984谱系的iav-s na包含与seq id no：16所示的氨基酸序列具有90％同一性、92％同一性、95％同一性或更高同一性的氨基酸序列。在这种类型更具体的实施方式中，na包含seq id no：16所示的氨基酸序列。在又一些其他实施方式中，来源于n2-意大利/2003谱系的iav-s na包含与seq id no：18所示的氨基酸序列具有90％同一性、92％同一性、95％同一性或更高同一性的氨基酸序列。在这种类型更具体的实施方式中，na包含seq id no：18所示的氨基酸序列。在其他实施方式中，来源于n2-苏格兰/1994(分支1)谱系的iav-s na包含与seq id no：20所示的氨基酸序列具有90％同一性、92％同一性、95％同一性或更高同一性的氨基酸序列。在这种类型更具体的实施方式中，na包含seq id no：20所示的氨基酸序列。在又一些其他实施方式中，来源于n2-苏格兰/1994(分支2)谱系的iav-s na包含与seq id no：22所示的氨基酸序列具有90％同一性、92％同一性、95％同一性或更高同一性的氨基酸序列。在这种类型更具体的实施方式中，na包含seq id no：22所示的氨基酸序列。

38、本发明提供了核酸构建体，其编码两种或更多种iav-s抗原或其抗原性片段。在具体实施方式中，核酸构建体编码两种至四种或更多种来源于iav-s的na抗原或其抗原性片段。在相关实施方式中，核酸构建体编码两种至四种或更多种来源于不同iav-s系统发生簇的na抗原或其抗原性片段。在某些实施方式中，核酸构建体编码来源于n1-经典系统发生簇的na或其抗原性片段和来源于n2-2002系统发生簇的na或其抗原性片段。在甚至更具体的实施方式中，核酸构建体编码来源于n2-2002系统发生簇的na或其抗原性片段，来源于n2-1998系统发生簇的na或其抗原性片段，来源于n1-大流行系统发生簇的na或其抗原性片段和来源于n1-经典系统发生簇的na或其抗原性片段。

39、在某些实施方式中，核酸构建体编码来源于n1-大流行(eu)谱系的na或其抗原性片段和来源于n1-欧亚禽类谱系的na或其抗原性片段。在其他实施方式中，核酸构建体编码来源于n2-根特/1984谱系的na或其抗原性片段和来源于n2-意大利/2003谱系的na或其抗原性片段。在另外其他实施方式中，核酸构建体编码来源于n2-根特/1984谱系的na或其抗原性片段和来源于n2-苏格兰/1994(分支1)谱系的na或其抗原性片段。在另外其他实施方式中，核酸构建体编码来源于n2-根特/1984谱系的na或其抗原性片段和来源于n2-苏格兰/1994(分支2)谱系的na或其抗原性片段。在另外其他实施方式中，核酸构建体编码来源于n2-意大利/2003谱系的na或其抗原性片段和来源于n2-苏格兰/1994(分支1)谱系的na或其抗原性片段。在另外其他实施方式中，核酸构建体编码来源于n2-意大利/2003谱系的na或其抗原性片段和来源于n2-苏格兰/1994(分支2)谱系的na或其抗原性片段。在另外其他实施方式中，来源于欧洲n1谱系之一的na或其抗原性片段与来源于欧洲n2谱系之一的na或其抗原性片段一起在同一核酸构建体中编码。类似地，本发明包括编码三种、四种或更多种na的核酸构建体，每种na来源于不同欧洲谱系。此外，本发明包括编码两种、三种、四种或更多种na的核酸构建体，每种na来源于不同欧洲谱系和/或系统发生簇。

40、因此，本发明还包括本发明的所有α病毒rna复制子颗粒，包含本发明的核酸构建体的裸dna载体，包含本发明的核酸构建体的裸rna载体，包含合成信使rna和rna复制子的本发明的核酸构建体，以及所有免疫原性组合物和/或疫苗，其包含本发明的核酸构建体(例如，合成信使rna、rna复制子)、α病毒rna复制子颗粒、裸rna载体和/或裸dna载体。

41、本发明还包含疫苗(多价疫苗)，其包含本发明的免疫原性组合物。在特定实施方式中，疫苗是无佐剂疫苗。在其他实施方式中，疫苗包含佐剂。在特定实施方式中，佐剂是可生物降解的油。在这种类型的具体实施方式中，可生物降解的油是dl-α-生育酚乙酸酯(维生素e乙酸酯)。在其他实施方式中，佐剂包含具有2.5％-50％(v/v)矿物油的水包油乳剂。在具体实施方式种，佐剂包含具有2.5％(v/v)矿物油的水包油乳剂。在相关实施方式中，佐剂包含具有5％(v/v)矿物油的水包油乳剂。在其他实施方式中，佐剂包含具有12.5％(v/v)矿物油的水包油乳剂。在另外其他实施方式中，佐剂包含具有25％(v/v)矿物油的水包油乳剂。在又一些其他实施方式中，佐剂包含具有50％(v/v)矿物油的水包油乳剂。在更具体的实施方式中，佐剂包含可降解的油与矿物油佐剂的混合物。具体实施方式中，可降解的油是dl-α-生育酚乙酸酯和矿物油是液体石蜡。在更具体的实施方式中，可降解的油是dl-α-生育酚乙酸酯和矿物油是轻质液体石蜡。

42、在某些实施方式中，疫苗有助于预防iav-s引起的疾病。在相关实施方式中，当使用疫苗免疫猪时，在猪受试者种诱导抗体。在某些实施方式中，猪受试者是母猪。在相关实施方式中，疫苗向接种母猪的后代提供保护性母源抗体。在其他实施方式中，猪受试者是仔猪。在这种类型的特定实施方式中，向最小3日龄的仔猪施用疫苗。在具体实施方式中，作为加强疫苗施用疫苗。在某些实施方式中，作为单剂疫苗施用疫苗。在这种类型的具体实施方式中，作为加强疫苗施用疫苗。在又一些其他实施方式中，作为多剂疫苗施用疫苗。在这种类型的具体实施方式中，作为两剂疫苗施用疫苗。

43、本发明还提供了针对猪病原体免疫猪(例如，母猪或仔猪)的方法，其包括向猪施用免疫有效量的本发明的疫苗或多价疫苗。在特定实施方式中，通过肌内注射施用疫苗。在替代实施方式中，通过皮下注射施用疫苗。在其他实施方式中，通过静脉内注射施用疫苗。在另外其他实施方式中，通过皮内注射施用疫苗。在又一些其他实施方式中，通过口服施用施用疫苗。在另外其他实施方式中，通过鼻内施用施用疫苗。

44、因此，本发明的疫苗和多价疫苗可以作为初免疫苗和/或加强疫苗施用。在具体实施方式中，本发明的疫苗是作为一次注射疫苗(一个剂量)施用的，不需要后续施用。在某些实施方式中，在施用初免疫苗和加强疫苗两者的情况下，可以以相同途径施用初免疫苗和加强疫苗。这种类型的某些实施方式中，初免疫苗和加强疫苗均通过皮内注射施用。在这种类型的其他实施方式中，初免疫苗和加强疫苗均通过肌内注射施用。在替代实施方式中，在施用初免疫苗和加强疫苗两者的情况下，初免疫苗的施用可以通过一种途径进行和加强疫苗可以通过另一种途径施用。在这种类型的某些实施方式中，初免疫苗可以通过皮内注射施用和加强疫苗可以口服施用。在这种类型的相关实施方式种，初免疫苗可以通过肌内注射施用和加强疫苗可以口服施用。在这种类型的其他实施方式中，初免疫苗可以通过肌内注射施用和加强疫苗可以通过皮内注射施用。在这种类型另外的其他实施方式中，初免疫苗可以通过皮内注射施用和加强疫苗可以通过肌内注射施用。

45、本发明还提供了针对iav-s免疫猪(例如，母猪或仔猪)的方法，其包括向猪施用免疫有效量的上文所述的本发明疫苗。在特定实施方式中，疫苗可以包含约1x104至约1x1010个rp或更多rp，例如。在更特定的实施方式中，疫苗可以包含约1x105至约1x109个rp。在甚至更特定的实施方式中，疫苗可以包含约1x106至约x108个rp。

46、在特定实施方式中，本发明的疫苗以0.05ml至3ml剂量施用。在更特定的实施方式中，所施用的剂量是0.1ml至2ml。在另外更特定的实施方式中，所施用的剂量是0.2ml至1.5ml。在甚至更特定的实施方式中，所施用的剂量是0.3ml至1.0ml。在另外更特定的实施方式中，所施用的剂量是0.4ml至0.8ml。

47、通过参考下述附图和具体实施方式，将更好地理解本发明的这些和其他方面。