阿氏芽孢杆菌与丛枝菌根真菌的协同应用方法与流程

本发明涉及生物，具体地说是阿氏芽孢杆菌与丛枝菌根真菌的协同应用方法。

背景技术：

1、据2020.03.23科技日报报道，经过对菌株进行耐高温、耐盐、耐酸碱、溶血安全性试验，我国的mb35-5菌株的16s序列与印度的阿耶波多杆菌16s rdna序列同源性高达99%以上，经国家菌种鉴定中心鉴定为阿氏芽孢杆菌，它具有超强的“解硅”性能，能与常用农药混配存活，可以制成一种生物活性硅肥。专利申请号201410167750.8报道了阿氏芽孢杆菌微生物菌剂及在抗高盐下促植物生长的应用；授权专利号201610330179.6公开了一株景天根际促生阿氏芽孢杆菌及其应用；授权专利号 201610368365.9公开了一株蓝莓专用的根际促生阿氏芽孢杆菌及其应用；授权专利号201610036163.4公开了阿氏芽孢杆菌j5具有产生长素，产铁载体，产氨，产蛋白酶，耐盐，拮抗及解磷等功能；授权专利号201610803675.9公开了一种茶树专用解磷解钾类复合菌剂及其制备方法；授权专利号201711081504.0公开了一株产中性生淀粉酶的阿氏芽孢杆菌；授权专利号201711396251.6公开了一株重盐碱地植物根际促生阿氏芽孢杆菌及其应用；授权专利号202010532445.x公开了一种高浓度阿氏芽孢杆菌菌剂的制备方法，该制备方法包括阿氏芽孢杆菌菌种活化培养、菌种发酵培养、电荷置换排斥法富集浓缩与喷雾干燥等步骤，获得高浓度液态菌剂和固体菌粉。授权专利号202010764651.3公开了一种包含木醋液的复合微生物制剂及其制备方法与应用；授权专利号202010819593.x筛选得到的阿氏芽孢杆菌具有高效抑制包括禾谷镰刀菌、产黑色素短梗霉、尖孢镰刀菌和立枯丝核菌等多种植物真菌病原菌的能力，使用后不会产生化学农药残留等一系列问题；授权专利202010691164.9公开了一种植物诱导剂的制备方法；授权专利202110697788.6公开了一株耐重金属铜的阿氏芽孢杆菌及应用，染阿氏芽孢杆菌jdd的植物种子在各浓度铜离子胁迫下，其萌发率保持在76 .7～91％之间；授权专利202111112565.5公开了一株芽孢杆菌及其在促生与降解水稻中毒死蜱的应用；申请号202111426718.3公开了一种微生物土壤修复剂及其制备方法，提供了一种微生物土壤修复剂，其包括阿氏芽孢杆菌mb35-5(bacillus aryabhattai)、豆粕、腐植酸盐、低阶煤、含硅矿物质，通过混合制备得到，制备得到的微生物土壤修复剂能够有效提高酸性土壤的ph，利于作物生长，提高产量。授权专利号202210230797.9公开了一株广谱抑菌的阿氏芽孢杆菌及其应用，能够有效控制松针褐斑病的发生；授权专利号202210026480.3公开了阿氏芽孢杆菌hz18-3及其用途，可耐受ph范围广，可通过固氮、解磷、产铁载体等促进植物生长发育，产纤维素酶分解纤维素，有利于土壤修复，同时能够有效抑制疮痂链霉菌的生长，抗性良好。河北萌帮生物科技有限公司授权专利202210572605.2一种微生物菌剂颗粒剂及其制备方法，提出一种微生物菌剂颗粒剂及其制备方法，解决了相关技术中微生物菌剂多采用多种有机质类物质和多种无机化肥混配，放置一段时间后造成高盐环境，活菌易失活，同时由于水分较高，种肥同播时易出现结块现象，限制了产品的使用范围和效果，不利于大面积种植作物推广普及的问题；南京林业大学的授权专利202210706553.3一株芽孢杆菌及其应用，公开了阿氏芽孢杆菌除了能固定大气氮，还具有溶有机磷和无机磷，解钾，分泌iaa的功能，该菌株为丰富薄壳山核桃促生菌菌种资源库，在薄壳山核桃微生物菌肥的开发，农林业生产上如减少化肥的使用，促进植物生长等方面具有重要意义。广西科学院授权专利202210655438.8公开了一种生物脱硫的阿氏芽孢杆菌及其应用；申请号为202211060367.的专利公开了一种芸苔素内酯-赤霉酸-阿氏芽孢杆菌复配药肥及其制备方法和应用；山西农业大学申请号为202210920265.8的专利公开了一种复合微生物菌剂及其制备方法和在防治草莓空心病中的应用。

2、丛枝菌根真菌（aarbuscular mycorrhizal fungi，amf）是广泛分布于各种类型土壤的一类特殊微生物，它可以与地球上约９０％维管植物的根系形成互惠共生体的菌根，并借助其外生菌丝在土壤中形成庞大的菌丝网络，帮助植物寄主从贫瘠的土壤中吸收营养，如p、zn、cu等在土壤中移动性较差的矿质养分，改善寄主的营养水平。它与“腐菌属”、“核盘菌属”、“轮枝菌属”、线虫引发的根腐病、维管束病害也有良好的防效，丛枝菌根真菌属于农业生产中的一种新型生物肥料，能显著上调玉米的碳磷代谢相关基因表达来响应低磷胁迫；在药用植物生长中，通过amf 的分泌物来调控丹参生长；amf 根外菌丝可以吸收土壤中的有机氮，并通过谷氨酰胺途径同化土壤中的有机氮将其转变为富氮的精氨酸；接种amf能增加叶绿素含量，增强郁金香对光能的利用效率，促进郁金香的生长，增加郁金香植株的生物量；接种 amf 可以提高蒲公英对矿质养分的吸收促进植株生长，稀释植株体内的铬浓度，缓解＂铬＂对蒲公英的毒害作用；接种 amf 真菌可以为药用植物提供营养元素，刺激药用植物的生长；通过影响药用植物的次生代谢过程，促进萜类和黄酮类等活性物质的合成来提高药用植物的品质；通过增加抗氧化酶活性，可溶性糖和可溶性蛋白的含量，增强植株的抗氧化能力。

3、林宇岚、张林平等以油茶（camellia oleiferaabel）、丛枝菌根（arbuscularmycorrhiza，am）真菌幼套近明球囊霉（claroideogolmus etuicatum）和解磷细菌阿氏芽孢杆菌（bacillus aryabhattai）为材料，利用盆栽实验，探究am 真菌和阿氏解磷细菌互作对油茶生长、磷含量的影响，得出 am 真菌和阿氏解磷细菌互作能够提高油茶地上磷浓度和根系磷浓度，且对油茶的促生作用要强于单一接种。

4、本发明在上海臻衍生物科技有限公司授权专利201710547574544丛枝菌根属真菌的复合培养基和共生包合物及其应用的基础上，融合阿氏芽孢杆菌的特点，进行克隆组装与产品生产。

技术实现思路

1、本发明为克服现有技术的不足，提供阿氏芽孢杆菌与丛枝菌根真菌的协同应用方法。

2、为实现上述目的，设计阿氏芽孢杆菌与丛枝菌根真菌的协同应用方法，其特征在于：包括如下步骤：

3、将阿氏芽孢杆菌与丛枝菌根真菌以1.0：4.0的比例进行混合培养，得到复合菌；

4、所述的阿氏芽孢杆菌的分类名为阿氏芽孢杆菌（bacillus aryabhattai），保藏地址为中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：cctcc no：m20232038，保藏时间为2023年10月25日。

5、还包括如下步骤：

6、s2，孢子质粒抽提，提取混合菌、阿氏芽孢杆菌、丛枝菌根真菌的dna；

7、s3，在体外将目的基因与载体dna结合成具有自我复制能力的dna分子；

8、s4，再通过转化或转染宿主细胞大肠杆菌中异源合成，筛选出含有目的基因的转化子；

9、s5，对目的基因进行扩增、提取获得大量同一dna或其表达产物。

10、所述的步骤s1中，阿氏芽孢杆菌与丛枝菌根真菌按照培养基msr:lb=4:1-9:1的比例共在28℃，80rpm/min的条件下培养8-9天。

11、所述的步骤s4的具体方法如下：

12、s41，将dna分子固定到固相载体磁珠上，利用固相载体清洗载体，进行连续消化、连接等工作，逐步的将rvd单元串联在一起；

13、s42，设计一段生物素修饰dna双链序列，长度为60bp，固定化到磁珠上；

14、s43，用限制性内切酶处理固定化dna双链序列，并产生３＇粘性末端，用限制性内切酶５＇处理tale连接单元，产生５＇粘性末端，并与上一步骤的３＇粘性末端互补配对结合，经过４或者１６次循环，拼接tale连接单元，最终可以得到固定化的１０或者２０连子；

15、s44，用限制性内切酶将连接好的dna双链分子从固相界面上剪切下来，通过凝胶电泳纯化；

16、s45，将纯化好的dna双链分子连接到talen骨架载体上，获得完整的talen表达质粒；并通过质粒转化通过菌落pcr检测和测序鉴定，最终可以得到单质粒核复合质粒，进行序列分析，筛选出目的基因。

17、所述的复合菌与lb培养基-含毛状根、泛酸钙、烟酸、维生素b1、b6、b12、黄腐酸组成msr培养基，混合，形成复合菌组合物。

18、所述的复合菌组合物为粉剂或液体剂。

19、所述的丛枝菌根真菌的获取方法包括如下步骤：取出太阳花、肾形草、千瓣葵盆中被丛枝菌根真菌浸染的材料，在平板内倒入20±10ml的pda培养基，加入50ml经过诱变处理的孢子液，用涂布棒均匀涂布后，在28.5℃下进行黑暗培养并保藏，保藏后筛选符合要求的突变株。

20、所述的丛枝菌根真菌的获取方法包括如下步骤：取出仿生泥炭基质包合物的丛枝菌根真菌，在平板内倒入20±10ml的pda培养基，加入100ml经过诱变处理的孢子液，用涂布棒均匀涂布后，在28.5℃下进行黑暗培养并保藏，保藏后筛选符合要求的突变株。

21、本发明同现有技术相比，利用阿氏芽孢杆菌和丛枝菌根真菌的共性，形成一种新型菌肥，可解钾固氮、迁移重金属离子，对土壤生态修复，对抗病害，对促进植物生长效果明显。