一种用于区分活细胞和死细胞的水溶性双光子荧光探针及其制备方法和应用

本发明属于荧光探针，具体涉及一种用于区分活细胞和死细胞的水溶性双光子荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术：

1、细胞凋亡是细胞的一种正常的生理过程，它去除多余或受损的细胞，特别是发生在胚胎发育过程中，并参与组织稳态的维持。区分活细胞和死细胞对于研究细胞凋亡具有重要意义。

2、已经开发了多种方法来鉴定活细胞/死细胞，包括磁共振成像(mri)、x射线计算机断层扫描、光学显微镜、电子显微镜。然而，这些方法耗时且成本高。荧光成像是一种最广泛使用的方法，用于灵敏、快速地鉴定活细胞/死细胞。到目前为止，已经开发出各种荧光材料来染色和区分活细胞/死细胞。由于小分子荧光探针具有高灵敏度和空间分辨率的优势，已成为区分活/死细胞的有力工具。

3、细胞核是真核细胞中一种膜包裹的细胞器，通过调节基因表达来维持遗传完整性并控制细胞活动。细胞核由含有蛋白质和磷脂分子的双层的核膜和大量的核孔组成，这些核孔是选择性亲水通道，允许小分子(如离子和代谢物)通过简单的扩散穿过膜表面。细胞核参与转录、基因复制和转录原代的处理。现在，细胞核成像可以为许多关于核相关事件的问题提供答案。

4、虽然现有技术中已经合成了通过靶向细胞核而达到区分活/死细胞的小分子荧光探针。但是这些探针中的大多数主要集中于特异性靶向活细胞的细胞核而不是靶向死细胞的细胞核，采用的策略通常是与商业细胞核染料hoechst结合。因此，开发特异性染色死细胞的细胞核的小分子荧光探针是有意义的。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提供了一种用于区分活细胞和死细胞的水溶性双光子荧光探针及其制备方法和应用，该水溶性双光子荧光探针能够特异性地染色死细胞的细胞核从而达到活/死细胞区分的目的，其具有荧光亮度高，stokes位移大，光稳定性好等优点。本发明提供的荧光探针是一种通用型的死细胞的细胞核染色剂，适用于正常细胞、癌细胞、神经元细胞等各种类型的细胞，且适用于多聚甲醛固定的或未固定的细胞。本发明中用于区分活/死细胞的水溶性双光子荧光探针的应用以固定的hela细胞的单光子荧光成像和神经元细胞sh-sy5y双光子荧光成像为例。

2、为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

3、本发明提供了一种用于区分活细胞和死细胞的水溶性双光子荧光探针，其特征在于，所述水溶性双光子荧光探针的结构式为：

4、

5、本发明还提供了所述用于区分活细胞和死细胞的水溶性双光子荧光探针的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

6、(1)合成醛基双取代的苯并噻二唑化合物btd-cho，所述btd-cho的结构式为：

7、(2)合成1-(3-三甲基胺基丙烷基)-4-甲基吡啶二溴化物py-br，所述py-br的结构式为：

8、(3)将btd-cho与py-br溶解于有机溶剂中，然后加入催化剂，于惰性气体保护下回流反应10～12h。反应结束后将反应液过滤，洗涤、干燥，即得到所述的用于区分活细胞和死细胞的水溶性双光子荧光探针btd-v。

9、步骤(1)中，所述btd-cho的合成方法包括以下步骤：将4,7-二溴-2,1,3-苯并噻二唑、4-醛基苯硼酸频哪醇酯、四丁基溴化铵、四(三苯基膦)钯、碳酸钾加入到甲苯、乙醇和去离子水的混合溶液中，在惰性气体氮气的保护下，75～80℃搅拌反应20～24h，反应结束后，反应液经萃取、浓缩、纯化、干燥，即得到所述btd-cho。

10、步骤(2)中，所述py-br的合成方法包括以下步骤：将4-甲基吡啶、(3-溴丙基)三甲基溴化铵加入到无水n,n-二甲基甲酰胺中，95～105℃搅拌反应1.5～2.5h，然后将反应液过滤、洗涤、干燥，即得到所述py-br。

11、进一步地，4-甲基吡啶、(3-溴丙基)三甲基溴化铵的摩尔比为1:1～1.1。

12、4-甲基吡啶在无水n,n-二甲基甲酰胺中的浓度为0.5～0.6m。

13、步骤(3)中，所述有机溶剂为无水乙醇；所述催化剂为哌啶；所述惰性气体为氮气。

14、步骤(3)中，btd-cho、py-br、哌啶的摩尔比为1：3.5～4.0：0.01～0.02。

15、步骤(3)中，btd-cho在无水乙醇中的浓度为0.01～0.02m。

16、本发明还提供了所述用于区分活细胞和死细胞的水溶性双光子荧光探针作为区分活细胞和死细胞成像中的应用。

17、本发明还提供了所述用于区分活细胞和死细胞的水溶性双光子荧光探针在细胞荧光成像中的应用。

18、本发明提供的水溶性双光子荧光探针的制备方法中，以醛基双取代的苯并噻二唑、1-(3-三甲基胺基丙烷基)-4-甲基吡啶二溴化物为原料，在催化剂的作用下简单方便地合成了用于区分活细胞和死细胞的水溶性双光子荧光探针btd-v，其结构特征为苯并噻二唑为荧光团，1-(3-三甲基胺基丙烷基)-4-甲基吡啶溴化物为水溶性基团，两者之间通过双键联接。btd-v分子间有个可以旋转的单键，当这个单键旋转时分子会发生扭曲。且此分子构型中有供体和受体，它们之间会发生电荷转移，btd-v分子间的扭曲及分子内电荷转移(tict)的发生，导致非辐射跃迁加剧，荧光强度减弱。但是当btd-v和细胞核内的dna结合后，探针btd-v进入到细胞核dna的小沟内，btd-v单键的旋转被抑制，荧光增强。共定位实验结果表明btd-v能够特异性地靶向死细胞的细胞核，这是因为细胞死亡后细胞膜的通透性改变，btd-v能够穿透死细胞的膜到达细胞核并对细胞核进行染色；而活细胞由于细胞膜的完整性，btd-v穿透不过细胞膜，因此无法对活细胞进行染色。为了进一步确认btd-v能够特异性识别死细胞的细胞核，用特异性染色死细胞的商业染料碘化吡啶(pi)和btd-v进行了细胞共染成像。双光子吸收光谱实验结果表明btd-v具有双光子性能，最大双光子吸收波长为750nm,和细胞核内dna结合后，双光子性能增强，且最大双光子吸收波长红移至790nm，吸收截面为78gm。其次，btd-v具有良好的光学性能，如水溶液中的荧光量子高，摩尔吸收系数大，stokes位移大，生物相容性好。更重要的是，它能够对死细胞的细胞核进行双光子荧光成像。因此，btd-v在细胞核相关的研究和监测中具有良好的应用前景。

19、与现有技术相比，本发明提供的用于区分活细胞和死细胞的水溶性双光子荧光探针btd-v具有生物相容性好、特异性强，荧光亮度高等优点。

技术特征：

1.一种用于区分活细胞和死细胞的水溶性双光子荧光探针，其特征在于，所述水溶性双光子荧光探针的结构式为：

2.如权利要求1所述的用于区分活细胞和死细胞的水溶性双光子荧光探针的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述btd-cho的合成方法包括以下步骤：将4,7-二溴-2,1,3-苯并噻二唑、4-醛基苯硼酸频哪醇酯、四丁基溴化铵、四(三苯基膦)钯、碳酸钾加入到甲苯、乙醇和去离子水的混合溶液中，在惰性气体氮气的保护下，75～80℃搅拌反应20～24h，反应结束后，反应液经萃取、浓缩、纯化、干燥，即得到所述btd-cho。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述py-br的合成方法包括以下步骤：将4-甲基吡啶、(3-溴丙基)三甲基溴化铵加入到无水n,n-二甲基甲酰胺中，95～105℃搅拌反应1.5～2.5h，然后将反应液过滤、洗涤、干燥，即得到所述py-br。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，4-甲基吡啶、(3-溴丙基)三甲基溴化铵的摩尔比为1:1～1.1。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述有机溶剂为无水乙醇；所述催化剂为哌啶；所述惰性气体为氮气。

7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，btd-cho、py-br、哌啶的摩尔比为1：3.5～4.0：0.01～0.02。

8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，btd-cho在无水乙醇中的浓度为0.01～0.02m。

9.如权利要求1所述的用于区分活细胞和死细胞的水溶性双光子荧光探针作为区分活细胞和死细胞成像中的应用。

10.如权利要求1所述的用于区分活细胞和死细胞的水溶性双光子荧光探针在细胞荧光成像中的应用。

技术总结本发明公开了一种用于区分活细胞和死细胞的水溶性双光子荧光探针及其制备方法和应用，以醛基双取代的苯并噻二唑、1‑(3‑三甲基胺基丙烷基)‑4‑甲基吡啶二溴化物为原料，在催化剂的作用下合成得到，该水溶性双光子荧光探针能够特异性地染色死细胞的细胞核从而达到活/死细胞区分的目的，其具有荧光亮度高，Stokes位移大，光稳定性好等优点；本发明提供的荧光探针是一种通用型的死细胞的细胞核染色剂，适用于正常细胞、癌细胞、神经元细胞等各种类型的细胞，且适用于多聚甲醛固定的或未固定的细胞；并以固定的HeLa细胞的单光子荧光成像和神经元细胞SH‑SY5Y双光子荧光成像为例证明了此荧光探针在细胞荧光成像中的应用。技术研发人员：高峰,张自伟,孙军勇受保护的技术使用者：安徽师范大学技术研发日：技术公布日：2024/12/2