清金化痰颗粒特征图谱检测方法及其特征图谱与流程

本发明属于药物分析的，具体涉及清金化痰颗粒特征图谱检测方法及其特征图谱。

背景技术：

1、清金化痰汤出自明代叶文龄的《医学统旨》，具有清热解毒、清肝去火、止咳化痰、止咳平喘、清喉利咽等功效，由黄芩、栀子、桔梗、麦冬、桑白皮、浙贝母、知母、瓜蒌子、橘红、茯苓、甘草共11种药味组成，该方是2018年4月发布的《古代经典名方目录（第一批）》中的第56首处方。

2、中药特征图谱是目前被广泛接受的一种中药质量评价模式，它的应用体现了中药全面质量管理的趋势，符合中药质量控制整体表征分析的特点，故开发特征图谱方法对于清金化痰汤及其复方制剂的质量控制尤为重要。

3、清金化痰汤由11味药材组成，其成分复杂，现有技术中的特征图谱方法多采用dad检测器，无法实现对桔梗、浙贝母、知母的质量控制。例如作者李莹曼，张林林，朱强等发表的《经典名方清金化痰汤物质基准指纹图谱及多指标含量测定研究》文献中，公开了采用高效液相色谱仪配备dad检测器，建立清金化痰汤物质基准指纹图谱，指认23个共有峰，其中峰1、2、3、4、6、7、8（栀子苷）、14、15、16、17归属于栀子；峰5为桑白皮与甘草共有；峰9（芒果苷）归属于知母；峰10归属于甘草；峰11、18（黄芩苷）、19、20、21、22、23（汉黄芩苷）归属于黄芩；峰12、13（橙皮苷）归属于橘红。该方法控制了栀子、黄芩、甘草、桑白皮、橘红、知母6味药材，未能表征桔梗、浙贝母、瓜蒌子、麦冬、茯苓的质量，且知母仅检测出芒果苷一个特征峰，知母的代表性成分同时也是《中国药典》含量测定的指标性成分知母皂苷bⅱ，并未得到控制。

4、中国药品标准2010年第11卷第6期446公开发表的“hplc-elsd测定金贝痰咳清颗粒中贝母素甲和贝母素乙的含量（李玥瑛，杨国亮等）”，采用高效液相色谱法hplc-elsd测定贝母素甲和贝母素乙，以乙腈-水-二乙胺流动相检测。该方法的流动相中含有0.03%的二乙胺，二乙胺浓度较高容易损伤色谱柱及检测器，并且采用等度洗脱，着重检测贝母素甲和贝母素乙的含量，只能控制浙贝母这一种药味，另外，该方法供试品溶液的制备中需要在80℃水浴中加热回流2h，操作复杂，时间较长，不利于日常检验。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述缺陷，提供清金化痰颗粒特征图谱检测方法，实现同时对桔梗、知母和浙贝母的质量控制，具有专属性强、重复性好、稳定性好的特点，本发明还提供其特征图谱。

2、本发明所述的清金化痰颗粒特征图谱检测方法，包括以下步骤：

3、（1）取桔梗皂苷d对照品配制成参照物溶液；

4、（2）取清金化痰颗粒配制成供试品溶液；

5、（3）分别将参照物溶液和供试品溶液，以及空白辅料溶液，按照以下色谱条件，注入液相色谱仪，进行测定，分别得到参照物溶液色谱图和供试品溶液色谱图，并对保留时间进行比对，得到清金化痰颗粒特征图谱；

6、所述的色谱条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，采用蒸发光散射检测器，以乙腈为流动相a，以0.008%-0.012%三乙胺溶液为流动相b，进行梯度洗脱，流速为0.9ml/min-1.0ml/min；柱温为33℃-37℃。三乙胺溶液的%是体积百分比。

7、步骤（1）的参照物溶液采用乙醇溶液或甲醇溶液溶解桔梗皂苷d对照品，具体为：取桔梗皂苷d对照品，精密称定，加60%乙醇制成每1ml含150μg的参照物溶液，即得。

8、步骤（2）的供试品溶液的配制：取清金化痰颗粒先加氨水浸润，再加入三氯甲烷-甲醇或二氯甲烷-甲醇混合溶液，超声处理，抽滤后，将固体蒸干，采用乙醇溶液或甲醇溶液定容，具体为：取清金化痰颗粒，研细，取0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加氨水5ml浸润1h，精密加入三氯甲烷-甲醇或二氯甲烷-甲醇（体积比4:1）的混合溶液20ml，密塞，混匀，超声或回流处理45min-75min，放冷，抽滤，并用三氯甲烷-甲醇或二氯甲烷-甲醇（体积比4:1）的混合溶液冲洗锥形瓶及滤纸，将所有溶液转移至蒸发皿，蒸干，残渣加乙醇溶液或甲醇溶液使溶解并转移至5ml量瓶中，用乙醇溶液或甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

9、步骤（3）的梯度洗脱条件为：

10、0-20min，流动相a的体积分数变化为20%-25%，流动相b的体积分数变化为80%-75%；

11、20-25min，流动相a的体积分数变化为25%-25%，流动相b的体积分数变化为75%-75%；

12、25-43min，流动相a的体积分数变化为25%-40%，流动相b的体积分数变化为75%-60%；

13、43-55min，流动相a的体积分数变化为40%-70%，流动相b的体积分数变化为60%-30%；

14、55-75min，流动相a的体积分数变化为70%-70%，流动相b的体积分数变化为30%-30%。

15、步骤（3）的色谱条件还包括：进样量为30μl；系统适用性要求：理论板数按桔梗皂苷d峰计算不低于3000。

16、步骤（3）中的空白辅料溶液为麦芽糊精采用乙醇溶液或甲醇溶液溶解得到的，具体为取麦芽糊精0.15g，加60%乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

17、步骤（1）、步骤（2）、步骤（3）所述的乙醇溶液或甲醇溶液，优选为60%乙醇、30%甲醇、60%vt甲醇、80%甲醇，进一步优选为60%乙醇。

18、步骤（3）的色谱柱为thermo acclaim™ 120 c18。

19、步骤（3）的蒸发光散射检测器型号为sedex 85型蒸发光检测器。

20、一种所述的清金化痰颗粒特征图谱检测方法得到的特征图谱：供试品溶液呈现6个特征峰，以2号峰桔梗皂苷d峰为参照物，其中1号峰、4号峰和5号峰来源于知母药材，2号峰和3号峰来源于桔梗药材，6号峰来源于浙贝母药材。

21、6个特征峰通过与对照品定位对比，1号峰为知母皂苷bⅱ，2号峰为桔梗皂苷d，5号峰为知母皂苷aⅲ，6号峰为贝母素甲。

22、对于本发明所述的清金化痰颗粒特征图谱检测方法，进行以下几个方面的方法验证：

23、一、系统适用性考察：取参照物溶液，采用与方法中相同的色谱条件，连续进样6次，记录色谱图，以桔梗皂苷d峰的保留时间和峰面积的rsd作为考察指标。

24、二、专属性考察：取空白辅料溶液、参照物溶液和供试品溶液，采用与方法中相同的色谱条件，记录色谱图，考察供试品溶液在参照物峰处有无色谱峰，空白辅料在各特征峰处是否有干扰。

25、三、重复性考察：取供试品溶液，平行制备6份，采用与方法中相同的色谱条件，每份溶液进样1次，记录色谱图，以2号峰桔梗皂苷d峰为参照物，计算1号、3-6号峰的相对保留时间，以各峰的相对保留时间的rsd作为考察指标。

26、四、中间精密度考察：更换分析人员，按照供试品溶液配制方式，平行制备6份，更换另一台液相色谱仪，采用与方法中相同的色谱条件，每份溶液进样1次，记录色谱图，以2号峰桔梗皂苷d峰为参照物，计算1号、3-6号峰的相对保留时间，以各峰的相对保留时间的rsd作为考察指标。

27、五、供试品溶液稳定性考察：取供试品溶液，在室温下放置0h、2h、4h、8h、12h、24h、36h、48h，采用与方法中相同的色谱条件，记录色谱图，以2号峰桔梗皂苷d峰为参照物，计算1号、3-6号峰的相对保留时间，以各峰的相对保留时间的rsd作为考察指标。

28、六、耐用性考察；取供试品溶液，取不同柱温、不同流速、不同三乙胺浓度、不同色谱柱，采用与方法中相同的色谱条件，记录色谱图，以2号峰桔梗皂苷d峰为参照物，计算1号、3-6号峰的相对保留时间，以各峰的相对保留时间的rsd作为考察指标。

29、与现有技术相比，本发明具有的有益效果是：

30、（1）本发明的清金化痰颗粒特征图谱检测方法，采用hplc-elsd方法建立清金化痰颗粒的特征图谱检测方法，共标定出6个特征峰，指认了桔梗皂苷d、知母皂苷bⅱ、知母皂苷aⅲ、贝母素甲4个特征成分。

31、（2）本发明方法专属性好、精密度高、重现性好、耐用性良好、溶液稳定性良好，更加全面、有效的控制清金化痰汤及其复方制剂的质量，确保疗效和用药安全。