制备BisulfiteDNA的方法及其应用与流程

本发明属于表观遗传，更具体地，本发明涉及一种制备bisulfite dna的方法及其应用。

背景技术：

1、表观遗传学主要包括dna甲基化(dna methylation)，组蛋白修饰(histonemodification)，microrna水平变化等生化过程；dna甲基化是本领域中研究较为深入的表观遗传学机制，在包括诊断和治疗在内的肿瘤临床实践中有着重要的应用前景。dna甲基化是指生物体内在dna甲基转移酶(dna methyltransferase，dmt)的催化下，以s-腺苷甲硫氨酸(sam)为甲基供体，将甲基转移到特定的碱基上的过程。dna甲基化可以发生在腺嘌呤的n-6位、胞嘧啶的n-4位、鸟嘌呤的n-7位或胞嘧啶的c-5位等。但在哺乳动物中dna甲基化主要发生在5’-cpg-3’的c上，生成5-甲基胞嘧啶(5mc)。

2、dna甲基化修饰在调控基因表达、维持染色质结构和稳定细胞遗传学等方面都起着重要作用。在基因表达调控方面，dna甲基化可以阻止转录因子的结合，并导致基因沉默。此外，dna甲基化还参与染色质的空间结构形成，影响基因座的亲缘规则。

3、dna甲基化在疾病的发生和发展中扮演着重要角色。许多研究已经发现，dna甲基化在某些癌症、心血管疾病和神经系统疾病中发生异常。例如，dna甲基化的异常可以导致某些肿瘤抑制基因的失活，从而促进肿瘤的发生。此外，dna甲基化的异常还与自闭症、帕金森病和阿尔茨海默病等神经系统疾病的发生和发展密切相关。

4、随着生物技术领域高通量测序和蛋白质组学技术的发展，甲基化修饰的研究也逐渐展开。研究人员不仅在基因组和蛋白质组水平上全面揭示了甲基化修饰的分布模式，还探索了甲基化修饰在疾病发生中的潜在机制。

5、目前，本领域中已经开发了一些dna甲基化检测用的试剂盒，以进行定性、定量或半定量的甲基化分析。然而，现有的检测方法还存在过程相对繁琐、耗时较长或信号相对差、灵敏度度不够等问题。

6、综上，本领域亟待开发提升甲基化修饰分析技术和工具，从而为甲基化水平的检测提供有力的工具和方法。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种制备bisulfite dna的方法及其应用。

2、在本发明的第一方面，提供一种制备bisulfite dna的方法，包括对细胞样本，以(仅以)含亚硫酸(氢)盐的试剂作为裂解转化试剂，获得经过转化的产物，所述产物的dna中非甲基化修饰的胞嘧啶转化为尿嘧啶，为bisulfite dna。

3、在一种或多种实施方式中，所述的方法包括：

4、(a)提供细胞样本；

5、(b)以含亚硫酸(氢)盐的试剂作为裂解转化试剂、处理(a)的样本，将样本中非甲基化修饰的胞嘧啶转化为尿嘧啶，获得经转化的产物；

6、条件在于，(a)中细胞样本进行选自以下(1)或(2)的处理：

7、(1)不进行细胞样本的裂解(不以常规裂解液的裂解，不以含亚硫酸(氢)盐的试剂以外的试剂实施裂解)，将细胞用于(b)步骤；或

8、(2)对细胞进行裂解，获得的裂解产物不进行dna样本洗涤或洗脱(较佳地，也不进行dna的分离)的步骤、用于(b)步骤，dna提取与转化一步进行。

9、在一种或多种实施方式中，所述方法将细胞样本中的dna转化为bisulfite dna；所述bisulfite dna中，非甲基化修饰的胞嘧啶转化为尿嘧啶(c→u)。

10、在一种或多种实施方式中，所述细胞样本包括来自组织的含细胞的样本。

11、在一种或多种实施方式中，所述(a)-(b)步骤包括下组步骤或由下组步骤组成：提供细胞样本，以含亚硫酸(氢)盐的试剂裂解及转化样本，获得经转化的产物。

12、在一种或多种实施方式中，所述(a)-(b)步骤包括下组步骤或由下组步骤组成：提供细胞样本，进行细胞裂解，以固相载体吸附dna，以亚硫酸(氢)盐处理经吸附处理的样本，获得经转化的产物。

13、在一种或多种实施方式中，所述固相载体选自：磁珠，磁珠、聚苯乙烯、玻璃。

14、在一种或多种实施方式中，所述(a)-(b)步骤以含亚硫酸(氢)盐的试剂处理时，亚硫酸(氢)盐浓度为15～75％，较佳地20～70％，更佳地30～60％，进一步更佳地40～50％。

15、在一种或多种实施方式中，所述(a)-(b)步骤以含亚硫酸(氢)盐的试剂处理时，温度为60～99℃，较佳地65～98℃，更佳地，68～96℃，进一步更佳地70～94℃(例如72℃、75℃、78℃、80℃、82℃、85℃、88℃、90℃、92℃)。

16、在一种或多种实施方式中，所述(a)-(b)步骤以含亚硫酸(氢)盐的试剂处理时，处理时间(转化时间)为5～40min，较佳地8～35min，更佳地10～30min(例如12、15、18、20、25、28min)。

17、在一种或多种实施方式中，所述亚硫酸(氢)盐包括：亚硫酸氢铵，亚硫酸铵，亚硫酸氢钠，亚硫酸钠，或其组合。

18、在一种或多种实施方式中，在(a)和(b)步骤之后，还包括：(c)对完成转化后dna进行脱磺、纯化；较佳地，所述纯化包括：洗涤和/或洗脱。

19、在一种或多种实施方式中，在(a)和(b)步骤以及可选的(c)步骤之后，完成转化的dna可用于进行扩增。

20、在本发明的另一方面，提供前面任一所述的方法在分析待测细胞样本的dna甲基化水平中的应用。

21、在一种或多种实施方式中，所述的分析待测细胞样本的dna甲基化水平为非诊断及非治疗性的方法，不以获得临床疾病诊断结果为直接目的。例如，针对离体的细胞进行科学研究和分析，确定其甲基化谱式。

22、在本发明的另一方面，提供一种分析待测细胞样本的dna甲基化水平的方法，包括：(i)提供待测细胞样本，以前面任一所述的方法制备bisulfite dna；(ii)分析所述bisulfite dna中尿嘧啶的存在情况，从而确定待测样本的甲基化水平。

23、在一种或多种实施方式中，步骤(i)之后，包括对bisulfite dna进行扩增的步骤。

24、在本发明的另一方面，提供一种用于制备bisulfite dna的试剂盒，所述试剂盒中包括：含亚硫酸(氢)盐的试剂，作为裂解转化试剂。

25、在一种或多种实施方式中，所述试剂盒中还包括选自下组的试剂：dna脱磺试剂，dna洗涤试剂，dna洗脱试剂，固相载体(如磁珠)。

26、在一种或多种实施方式中，所述试剂盒中不包括额外的(含亚硫酸(氢)盐的试剂以外的)细胞裂解试剂。

27、在一种或多种实施方式中，所述试剂盒中还包括使用说明书，说明以(仅以)含亚硫酸(氢)盐的试剂作为裂解转化试剂，获得经过转化的产物，所述产物的dna中非甲基化修饰的胞嘧啶转化为尿嘧啶；更佳地，说明对细胞样本进行选自以下(1)或(2)的处理：(1)不进行细胞样本的裂解(不以含亚硫酸(氢)盐的试剂以外的试剂裂解)，将细胞用于转化步骤：或(2)对细胞进行裂解，获得的裂解产物不进行dna样本洗涤或洗脱(较佳地，也不进行dna的分离)的步骤、用于转化步骤，dna提取与转化一步进行。

28、在一种或多种实施方式中，所述使用说明书还说明以含亚硫酸(氢)盐的试剂处理时：亚硫酸(氢)盐浓度为15～75％，较佳地20～70％，更佳地30～60％，进一步更佳地40～50％；和/或，温度为60～99℃，较佳地65～98℃，更佳地，68～96℃，进一步更佳地70～94℃(例如72℃、75℃、78℃、80℃、82℃、85℃、88℃、90℃、92℃)；和/或，处理时间(转化时间)为5～40min，较佳地8～35min，更佳地10～30min(例如12、15、18、20、25、28min)。

29、在本发明的另一方面，提供所述的试剂盒在分析待测细胞样本的dna甲基化水平中的应用，或在制备分析待测细胞样本的dna甲基化水平的检测系统中的应用。

30、在本发明的另一方面，提供含亚硫酸(氢)盐的试剂在制备细胞样本裂解转化试剂中的应用；较佳地，所述亚硫酸(氢)盐的浓度为15～75％；较佳地，所述亚硫酸(氢)盐的处理温度为60～99℃。

31、在本发明的另一方面，提供一种用于细胞样本的裂解方法，进行如下步骤：(a)提供细胞样本；和，(b)以含亚硫酸(氢)盐的试剂处理(a)的样本，处理温度为60～99℃(较佳地70～98℃)，时间5～40min(较佳地5～30min)。

32、本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。