一种分离的转座酶及其用途的制作方法

本技术涉及分子生物学领域，具体涉及一种分离的转座酶及其用途。本技术还具体涉及：一种编码所述转座酶的核酸及核酸构建体，一种核酸组及核酸组构建体，以及一种包含所述转座酶的组合物、重组载体、重组宿主细胞和试剂盒。本技术还具体涉及：一种将外源核酸片段引入宿主细胞基因组的方法，一种对宿主细胞基因组进行编辑的方法，以及一种获得基因组中包含外源核酸片段的宿主细胞的方法。本技术还具体涉及所述转座酶、所述核酸及核酸构建体、所述核酸组及核酸组构建体、所述组合物、所述重组载体、或所述重组宿主细胞在将外源核酸片段基因引入宿主细胞基因组中的用途，或在制备基因疗法、细胞疗法、基因组研究、或干细胞诱导和诱导后分化的药物或制剂中的用途。

背景技术：

1、转座子是一种可以在基因组内插入或切除，从而在基因组内或基因组间转移自身序列或自身序列的完整拷贝的dna序列。转座子主要分为两大类，本文所涉及的主要是ii型转座子(dna转座子)，由两端的末端反向重复序列(terminal inverted repeat，tir)和编码转座酶的基因构成。转座子具有“剪切粘贴”的转座机制，将dna从染色体上切下后直接插入到基因组其他的部位。

2、转座酶是由dna转座子序列表达的、具有序列特异性的dna结合蛋白，包含着介导dna断裂和连接的催化结构域。转座酶会识别并结合转座子两端的tir，形成突起复合物，之后将dna转座子从原位点移除并整合到新的位点上。转座子的转座活性主要取决于转座酶的表达水平和活性。因此，具有高转座酶活性的dna转座子是开发基于转座子功能的基因编辑工具的主要要求。

3、大片段的基因插入和整合在基因疗法、动植物分子育种、工业微生物改造等领域有重要应用价值。目前，在工业中缺乏用于大片段基因插入和整合的有效工具和系统。近年来，科学界已经开发了一些能够插入和整合大片段基因的工具和方法，但这些方法仍然存在一些问题。例如，在细胞免疫疗法和遗传性疾病基因疗法中整合基因序列使用最多的是慢病毒或逆转录病毒，已有若干基于此的疗法产品用于肿瘤和遗传性疾病的治疗(aiuti,a.,roncarolo,m.g.和naldini,l.(2017)gene therapy for ada-scid,the firstmarketing approval of an ex vivo gene therapy in europe:paving the road forthe next generation of advanced therapy medicinal products.[ada-scid基因疗法，欧洲首次离体基因疗法上市批准：为下一代先进治疗药物产品铺平道路]embo mol.med.[embo分子医学]9,737–740；aiuti,a.等人(2009)gene therapy for immunodeficiencydue to adenosine deaminase deficiency.[腺苷脱氨酶缺乏所致免疫缺陷的基因疗法]n.engl.j.med.[新英格兰医学杂志]360,447–458)。然而利用病毒进行大片段的基因整合有一些潜在的应用上的限制：第一，病毒在基因组整合的随机性会产生致癌的风险；第二，病毒能承载的外源基因的大小也是受限的，不利于大片段的治疗基因的转移；第三，病毒的免疫原性可能会影响外源治疗基因的长期表达以及再次给药；第四，病毒的生产需借助活细胞来完成，使得这样的产品的质控和下游的处理更为复杂，成本也更高，在产业化方面存在一定劣势。因此，非病毒类的大片段整合可以避免病毒类整合带来的各种弊端，成为基因疗法中一种有价值的工具。

4、作为一种非病毒类的基因整合工具，dna转座子不仅可以实现外源基因大片段在宿主基因组的整合及稳定表达，还能规避免疫原性等负面影响，因此已有部分转座子被用于基因疗法中。尽管转座子已被证实广泛存在于从原核到真核的各个领域中，但是在进化过程中，为了保持基因组的稳定性，有大量的转座子片段变为沉默失活。目前，sleepingbeauty(sb)、piggybac(pb)和tol2等少数活性较高且具有价值的转座子工具被用于基因疗法研究中。因此，更多高活性的转座子工具的挖掘及对其功能的验证和检测，可为基因疗法策略的开发提供更多更好的及灵活的选择。

5、需要注意的是，在此部分中描述的方法不一定是之前已经设想到或采用的方法。除非另有指明，否则不应假定此部分中描述的任何方法仅因其包括在此部分中就被认为是现有技术。类似地，除非另有指明，否则此部分中提及的问题不应认为在任何现有技术中已被公认。

技术实现思路

1、基于此，为了寻求更先进且更有效的非病毒类基因整合工具，本技术提供了一种分离的转座酶，其中该转座酶具有选自下述(i)的转座酶序列或(ii)-(iv)中的具有转座酶活性的前述转座酶的变体序列：(i)seq id no:1-79中任一个所示的氨基酸序列中的至少一个；(ii)seq id no:1-79中任一个所示的氨基酸序列缺失、取代、插入或突变1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸而获得的序列中的至少一个；(iii)与seq id no:1-79中任一个所示的氨基酸序列具有至少70％、80％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列中的至少一个；以及(iv)seq id no:1-79中任一个所示的氨基酸序列进一步融合其他序列而获得的序列中的至少一个。本技术提供的转座酶与现在被广泛使用的sleeping beauty(sb)和piggybac(pb)相比，具有相当甚至更高的转座活性，为基因整合工具的开发提供更多的或更好的选择。

2、根据本技术的实施例，可以提供一种分离的转座酶，其中该转座酶包含式(i)所示的氨基酸序列：

3、d e(i)

4、其中d为天冬氨酸；以及e为谷氨酸。

5、根据本技术的实施例，可以提供一种分离的转座酶，其中该转座酶包含式(ii)所示的氨基酸序列：

6、d(x1)a h(ii)

7、其中d为天冬氨酸；h为组氨酸；a为氨基酸数量；以及(x1)为任意的氨基酸，且a为5。

8、根据本技术的实施例，可以提供一种分离的转座酶，其中该转座酶包含式(iii)所示的氨基酸序列：

9、p(x2)(x3)(iii)

10、其中p为脯氨酸；x2为任意的氨基酸；以及x3为天冬氨酸或谷氨酸。

11、根据本技术的实施例，可以提供一种分离的转座酶，其中该转座酶包含式(i)、式(ii)和式(iii)所示的氨基酸序列中的至少两个。

12、根据本技术的实施例，可以提供一种分离的转座酶，其中该转座酶包含式(i)、式(ii)和式(iii)所示的氨基酸序列。

13、根据本技术的实施例，可以提供一种核酸，其中该核酸编码本技术所述的转座酶。

14、根据本技术的实施例，可以提供一种核酸构建体，其包含根据本技术的核酸，还包含启动子。

15、根据本技术的实施例，可以提供一种核酸组，其中5’识别序列包含seq id no:80-158所示的核苷酸序列中的至少一个。

16、根据本技术的实施例，可以提供一种核酸组，其中3’识别序列包含seq id no:159-237所示的核苷酸序列中的至少一个。

17、根据本技术的实施例，可以提供一种核酸组，其包含5’识别序列和3’识别序列，其中该5’识别序列包含seq id no:80-158中任一个所示的核苷酸序列或其变体，该3’识别序列包含seq id no:159-237中任一个所示的核苷酸序列或其变体，并且该核酸组能被特定的转座酶所识别。

18、根据本技术的实施例，可以提供一种核酸组构建体，该核酸组构建体包含本技术所述的核酸组，还包含外源核酸片段。

19、根据本技术的实施例，可以提供一种组合物，其中该组合物包含：tc1/mariner超家族转座酶或其功能片段，或编码所述tc1/mariner超家族转座酶或其功能片段的核酸，其中所述转座酶或其功能片段具有催化外源核酸片段插入到细胞基因组的功能；以及核酸组，其中所述核酸组能被特定的转座酶或其功能片段所识别。

20、根据本技术的实施例，可以提供一种重组载体，其中该重组载体包含编码本技术所述的转座酶的核酸、本技术所述的核酸、本技术所述的核酸构建体、本技术所述的核酸组、本技术所述的核酸组构建体、或本技术所述的组合物。

21、根据本技术的实施例，可以提供一种重组宿主细胞，其中该重组宿主细胞包含本技术所述的转座酶、编码本技术所述的转座酶的核酸、本技术所述的核酸、本技术所述的核酸构建体、本技术所述的核酸组、本技术所述的核酸组构建体、本技术所述的组合物、或本技术所述的重组载体。

22、根据本技术的实施例，可以提供一种将外源核酸片段引入宿主细胞基因组的方法，其中该方法包括：将本技术所述的转座酶、编码本技术所述的转座酶的核酸、本技术所述的核酸、本技术所述的核酸构建体、本技术所述的核酸组、本技术所述的核酸组构建体、本技术所述的组合物、或本技术所述的重组载体递送进宿主细胞。

23、根据本技术的实施例，可以提供一种对宿主细胞基因组进行编辑的方法，其中该方法包括：将本技术所述的转座酶、编码本技术所述的转座酶的核酸、本技术所述的核酸、本技术所述的核酸构建体、本技术所述的核酸组、本技术所述的核酸组构建体、本技术所述的组合物、或本技术所述的重组载体递送进宿主细胞。

24、根据本技术的实施例，可以提供一种获得基因组中包含外源核酸片段的宿主细胞的方法，其中该方法包括：将本技术所述的转座酶、编码本技术所述的转座酶的核酸、本技术所述的核酸、本技术所述的核酸构建体、本技术所述的核酸组、本技术所述的核酸组构建体、本技术所述的组合物、或本技术所述的重组载体递送进宿主细胞。

25、根据本技术的实施例，可以提供本技术所述的转座酶、编码本技术所述的转座酶的核酸、本技术所述的核酸、本技术所述的核酸构建体、本技术所述的核酸组、本技术所述的核酸组构建体、本技术所述的组合物、本技术所述的重组载体、或本技术所述的重组宿主细胞在将外源核酸片段引入宿主细胞基因组中的用途。

26、根据本技术的实施例，可以提供本技术所述的转座酶、编码本技术所述的转座酶的核酸、本技术所述的核酸、本技术所述的核酸构建体、本技术所述的核酸组、本技术所述的核酸组构建体、本技术所述的组合物、本技术所述的重组载体、或本技术所述的重组宿主细胞在制备基因疗法、细胞疗法、基因组研究、或干细胞诱导和诱导后分化的药物或制剂中的用途。

27、根据本技术的实施例，可以提供一种试剂盒，其中该试剂盒包含本技术所述的转座酶、编码本技术所述的转座酶的核酸、本技术所述的核酸、本技术所述的核酸构建体、本技术所述的核酸组、本技术所述的核酸组构建体、本技术所述的组合物、本技术所述的重组载体、或本技术所述的重组宿主细胞。

28、应当理解，本部分所描述的内容并非旨在标识本技术的示例的关键或重要特征，也不用于限制本技术的范围。本技术的其它特征将通过以下的说明书而变得容易理解。