促进人羊膜间充质干细胞向血管内皮细胞分化的方法

本发明属于生物医学工程，具体涉及到干细胞，干细胞命运调控，干细胞组织工程等技术，尤其是一种促进人羊膜间充质干细胞向血管内皮细胞分化的方法。

背景技术：

1、心血管疾病是全球范围内导致死亡的主要原因之一，特别是缺血性心血管疾病，如冠心病和脑卒中等，它们通过影响血氧供应和组织愈合，严重威胁患者的生命健康。在细胞治疗和再生医学领域，输注血管内皮细胞(vec)或植入人工心血管组织已被证明可以显著改善缺血区域的血液供应，为治疗这些疾病提供了新的希望。然而，当前面临的主要挑战之一是功能性vec的数量严重不足，迫切需要一种安全、稳定且高效的vec获取方法。

2、传统的vec获取方法主要分为两类：自体vec的分离和扩增，以及干细胞的定向分化。自体vec的方法受限于样本量有限、侵入性操作和功能退化等问题，难以满足临床需求。而干细胞分化方法虽然具有自我更新和多向分化的潜力，但目前分化体系存在效率低、时间长、毒副作用大等缺陷，限制了其临床应用。此外，胚胎干细胞和诱导多能干细胞虽然具有强大的扩增和分化能力，但存在伦理争议、致瘤风险和基因安全性问题，限制了它们的广泛应用。

3、成体干细胞(asc)因其低免疫原性和伦理风险小而被视为有潜力的干细胞资源，但它们的体内含量低，获取过程侵入性，且存在分离提纯效率低的问题。近年来，人羊膜间充质干细胞(hamsc)因其独特的优势而受到关注，它们来源于胎盘，具有多能性、无免疫排斥反应、低致瘤性，且易于获取和扩增。研究表明，hamsc能够在体内外分化为vec，并在人工血管模型中表现出促进血管再生和抗血栓的特性。

4、尽管hamsc展现出作为vec来源的巨大潜力，但传统的干细胞向vec分化的诱导体系主要依赖血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,vegf)等生物大分子。但这些大分子活性物质介入纷繁的细胞生理和信号转导过程，具有多重调控能力，其分化诱导效果较低，亟待提高。因此，开发一种新的分化体系，以提高hamsc向vec分化的效率和功能，同时减少潜在的毒副作用，对于推动干细胞治疗心血管疾病的临床应用具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种促进人羊膜间充质干细胞向血管内皮细胞分化的方法，该方法通过优化分化体系，提高分化效率，减少分化过程中的潜在风险，以期达到更安全、更有效的心血管疾病治疗目的。

2、本发明的一种促进人羊膜间充质干细胞向血管内皮细胞分化的方法，包括以下步骤：制备静电纺丝薄膜作为细胞培养基底；在静电纺丝薄膜上种植人羊膜间充质干细胞hamsc；向培养基中加入血管内皮生长因子vegf以诱导hamsc分化；维持细胞培养至血管内皮细胞特征表达。

3、本发明的方法利用了静电纺丝技术制备的薄膜作为细胞培养基底，该薄膜能够提供类似细胞外基质的微环境，从而有利于细胞的黏附、增殖和分化。通过在培养基中加入vegf，能够特异性地诱导hamsc向血管内皮细胞方向分化，最终实现血管内皮细胞特征的表达。本发明的方法不仅提高了分化效率，而且为组织工程和再生医学提供了一种新的细胞来源，有助于解决现有技术中血管内皮细胞数量不足的问题。

4、作为进一步的优选方案，所述静电纺丝薄膜由聚乳酸-聚己内酯共聚物plcl制备而成。通过使用聚乳酸-聚己内酯共聚物(plcl)作为静电纺丝薄膜的材料，为hamsc提供了一种生物相容性好、可降解的细胞培养基底。plcl作为一种生物可降解材料，能够在细胞培养过程中逐渐降解，从而减少对细胞的长期异物刺激。此外，plcl的降解产物是乳酸和己内酯，这些物质在体内可以自然代谢，降低了对细胞培养环境的潜在影响。使用plcl薄膜作为细胞培养基底，有助于维持细胞的正常生理状态，促进细胞的长期稳定分化。

5、作为进一步的优选方案，所述静电纺丝薄膜的制备至少包括以下步骤：将plcl颗粒溶解于溶剂中形成纺丝液；利用静电纺丝技术制备薄膜；对薄膜进行后续处理，包括冷冻干燥、紫外线灭菌和明胶孵育。本发明通过一系列精细的静电纺丝薄膜制备步骤，确保了薄膜的质量和性能，从而为hamsc的培养和分化提供了一个优良的平台。首先，将plcl颗粒溶解于溶剂中形成纺丝液，利用静电纺丝技术可以制备出具有特定微米或纳米级纤维结构的薄膜，这种结构模仿了天然细胞外基质的形态，有利于细胞的黏附和生长。其次，对薄膜进行冷冻干燥和紫外线灭菌处理，既保证了薄膜的孔隙结构，又确保了其无菌性，适合细胞培养。最后，通过明胶孵育处理，进一步增强了薄膜的细胞黏附性，为hamsc的种植和分化创造了有利条件。这些技术步骤的综合应用，显著提高了静电纺丝薄膜作为细胞培养基底的性能，为hamsc的高效分化提供了重要保障。

6、作为进一步的优选方案，所述vegf的浓度为50ng/ml。vegf的浓度精确至50ng/ml，不仅确保了分化过程中所需的有效浓度，而且有助于维持细胞培养的成本效益。此浓度的选择可能基于实验数据，显示在此水平下，hamsc的分化效率最高，同时避免了因浓度过高而可能引起的细胞过度增殖或功能异常。

7、作为进一步的优选方案，所述细胞培养过程中每2天更换一次含有vegf的培养基，持续时间为14天。通过每2天更换一次含有vegf的培养基，并持续14天，确保了分化过程中vegf的持续存在和作用。这种周期性的更换机制不仅保证了培养环境中营养成分的更新，还有助于去除可能积累的代谢废物或抑制因子，从而为细胞提供了一个稳定和优化的微环境。此外，14天的持续培养时间可能是基于实验观察，认为这一时间段足以实现hamsc到血管内皮细胞的有效分化。

8、作为进一步的优选方案，还包括通过免疫荧光染色和实时荧光定量聚合酶链式反应qrt-pcr来检测血管内皮细胞特异性标志物cd31的表达。通过免疫荧光染色和实时荧光定量聚合酶链式反应(qrt-pcr)检测血管内皮细胞特异性标志物cd31的表达，可以直观地观察到细胞形态的变化和基因表达水平的定量分析。这种方法的应用不仅有助于监测和验证分化过程的成功，还可以通过分析cd31的表达模式来进一步了解分化过程中的分子机制。此外，这种检测方法的建立为干细胞分化研究提供了一种标准化的评估手段，有助于提高实验结果的可靠性和重复性。

9、作为进一步的优选方案，所述qrt-pcr来检测血管内皮细胞特异性标志物cd31的表达包括设计目标基因定量pcr反应引物对cd31基因进行扩增，以定量分析hamsc向血管内皮细胞分化的效率；所述目标基因定量pcr反应引物具有seq id no:1-seq id no:4所示的16s rdna序列。通过指定seq id no:1-seq id no:4所示的16s rdna序列作为目标基因定量pcr反应引物的一部分，确保了qrt-pcr实验的特异性和准确性。这种特定序列的使用有助于避免非特异性扩增，从而提高了实验结果的可信度。此外，明确引物序列为实施该技术方案的研究人员提供了明确的指导，使得该方法可以被其他研究者或实验室复制和验证，有助于推动该领域内知识的积累和技术的标准化。

10、作为进一步的优选方案，所述静电纺丝薄膜的表面经过特殊处理以增加细胞黏附性，所述特殊处理包括等离子处理或涂层改性。通过特殊处理静电纺丝薄膜表面，显著提高了hamsc的细胞黏附性。这种特殊处理包括等离子处理或涂层改性，能够有效改善薄膜的表面特性，从而增加细胞与材料之间的相互作用。等离子处理可以激活材料表面，增加表面粗糙度和化学活性，而涂层改性则可能涉及覆盖具有特定生物活性的分子层。这些处理不仅促进了初始的细胞黏附，还可能影响细胞的增殖和分化行为，为hamsc提供了更加适宜的生长微环境，进而提高了整个分化过程的效率和效果。

11、作为进一步的优选方案，所述hamsc的种植密度为每平方厘米104到105个细胞，并且种植后在37℃、5％co2的条件下培养。种植密度的精确控制确保了细胞在培养过程中具有适当的空间和营养供应，避免因过密或过稀导致的细胞生长抑制或不利的分化结果。此外，37℃和5％co2的培养条件模拟了人体内的生理环境，有助于维持细胞的正常代谢和功能状态。这些条件的优化有助于实现hamsc向血管内皮细胞的有效分化，并为后续的细胞功能研究和应用提供了标准化的培养方法。

12、作为进一步的优选方案，所述方法进一步包括以下步骤：在hamsc种植前，使用流式细胞仪对细胞进行纯度检测，确保细胞纯度达到95％以上；在诱导分化过程中，定期使用细胞活性试剂盒评估细胞活性，以确保细胞在培养过程中保持高活性。通过一系列质量控制措施，确保了hamsc的高纯度和高活性，这对于提高分化效率和获得功能性血管内皮细胞至关重要。流式细胞仪的使用可以在种植前对hamsc进行纯度检测，排除可能影响分化效果的杂质细胞，确保实验的准确性。同时，在诱导分化过程中定期使用细胞活性试剂盒评估细胞活性，可以及时发现并调整培养条件，防止细胞因环境变化或营养不足而受损。这些措施的实施有助于维持细胞培养过程中的稳定性和可重复性，为获得高质量的血管内皮细胞提供了保障。

13、综上所述，与现有技术相比：

14、首先，本发明采用了聚乳酸-聚己内酯共聚物(plcl)作为静电纺丝薄膜的材料，这种材料不仅具有良好的生物相容性和生物可降解性，而且通过静电纺丝技术制备的薄膜具有独特的三维网状纤维结构，为细胞提供了一个更加接近天然细胞外基质的生长环境。这种结构能够有效促进人羊膜间充质干细胞(hamsc)的黏附、增殖，并在血管内皮生长因子(vegf)的诱导下向血管内皮细胞分化，从而显著提高了分化效率。

15、其次，本发明在细胞培养过程中采用了精确控制的vegf浓度和周期性更换培养基的方法，保证了分化过程中所需的营养和生长因子的持续供应，同时避免了代谢废物的积累，为hamsc的稳定分化提供了优化的培养条件。此外，通过免疫荧光染色和实时荧光定量聚合酶链式反应(qrt-pcr)等检测手段，本发明能够准确评估hamsc向血管内皮细胞分化的效果，确保了实验结果的可靠性和重复性。

16、最后，本发明在技术实施方面进行了创新，包括对静电纺丝薄膜表面的特殊处理以增加细胞黏附性，精确控制hamsc的种植密度和培养条件，以及在分化过程中对细胞纯度和活性的定期评估。这些措施进一步提高了分化效率，确保了获得的血管内皮细胞具有高纯度和高活性，为心血管疾病的治疗和组织工程提供了一种新的细胞来源。通过这些实质性的技术创新，本发明不仅解决了现有技术中存在的问题，还为干细胞分化和应用开辟了新的道路。