人多能干细胞3D分化来源的人上皮干细胞3D-hEpSC及其培养基和应用的制作方法

本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种人多能干细胞3d分化来源的人上皮干细胞3d-hepsc及其培养基和应用。

背景技术：

1、毛囊的形态发生和再生依赖于上皮(上皮干细胞[epsc])和毛发诱导间充质(真皮毛乳头细胞[dpc])成分的密切合作，也称为上皮-间充质相互作用(emi)。emi是功能性毛囊形成、再生和循环的先决条件，并作为组织工程用于毛囊再生的理论基础。

2、目前体内再生毛囊的策略旨在模拟emi，主要采用结合上皮(上皮干细胞[epsc]或人表皮角质形成细胞(human epidermal keratinocytes，简称hek)和间充质(真皮毛乳头细胞[dpc]或皮肤来源的前体细胞(skin-derived precursors，简称skp))配合诱导毛囊再生。

3、目前，人表皮角质形成细胞hek、真皮毛乳头细胞dpc、皮肤来源的前体细胞skp等细胞均可以在体外获得。有研究报道，移植真皮细胞和上皮细胞混合物可使功能性毛囊再生，但仅接受真皮细胞(例如dpc)的小鼠都没有可见的毛发生长(dpc可能能诱导毛囊结构，但没有可见的毛发穿出生长，见图8)，说明虽然真皮细胞(例如dpc)在单独注射时不能诱导获得可检测到的毛发生长，但当真皮细胞(例如dpc)与上皮细胞(例如hek)混合时，有助于头发穿出并生长，对于研究毛发再生具有重要意义。

4、但是，毛发再生的研究仍然面临很多挑战，例如，人类上皮细胞主要来源有两种，一种是用人类皮肤或毛囊组织进行原代分离(例如原代分离的hek细胞)，但来源有限且较难增殖；另一种是使用多能干细胞进行分化获得，可以解决细胞来源问题，而多能干细胞分化有两种路径，一种是单层细胞贴附培养的2d分化路径，优点是操作简单成本低，易于观察和大规模生产；另一种是先形成细胞团(拟胚体或称eb球)再进行贴壁分化的3d分化路径，尽管3d分化技术相对复杂，成交较高，观察和操作难度大，但由于可以更好地模拟体内三维环境，功能更接近体内细胞，具有更大的研究价值。

5、但目前的3d分化仍然存在很大的挑战，包括：

6、(a)目前有较多的方法和培养基可以使多能干细胞形成细胞团(拟胚体或称eb球)，例如，自聚集、悬滴法和aggrewell等方法均可形成eb球，但并不是所有方法都有利于hpsc向hepsc的分化，例如，形成eb球后分化时出现容易破裂和不贴壁的问题，或者形成eb球后前期贴壁分化正常，但分化到后期还会出现容易出现开裂和贴壁差的问题。

7、(b)已有的3d分化培养体系时程过长(普遍在30-50天)、分化效率不稳定(需要连续传代纯化才能获得人上皮细胞)，限制了它们的临床应用。

技术实现思路

1、发明目的

2、为克服上述不足，本发明的目的在于提供一种人多能干细胞3d分化来源的人上皮干细胞3d-hepsc及其培养基和应用。本发明在研究人多能干细胞(hpsc)3d分化拟获得hek细胞的过程中，意外获得了一种不同于hek、传统毛囊来源的hepsc的新的人上皮干细胞3d-hepsc，分化获得的人上皮干细胞3d-hepsc在mrna水平上高表达上皮干细胞标志物细胞角蛋白5(krt15)、角蛋白18(k18)、p63和itga6(整合素亚基α6)，而不表达或低表达与hek特异性相关的标志物角蛋白14(k14)(区别于hek)和与hpsc相关的标志物oct4和nanog(安全性高，不具有潜在成瘤性)，也极低表达cd200(不同于传统的毛囊来源的hepsc)，itga6的相对表达量也远低于传统的毛囊来源的hepsc。本发明通过人多能干细胞(hpsc)可快速、稳定且高效地分化为人上皮干细胞3d-hepsc，分化时间大大缩短(分化时间仅需14～20天)，本发明获得的细胞团(eb球)能高效分化，不容易破裂或贴壁变差，分化稳定性大大提高。且本发明的人上皮干细胞3d-hepsc的以人多能干细胞(hpsc)为获取来源，获取简便，本发明获得的人上皮干细胞3d-hepsc在与dpc细胞混合移植时，能成功让裸鼠长出大量毛发，具有巨大的临床应用价值。

3、解决方案

4、为实现本发明目的，本发明采用的技术方案如下：

5、第一方面，本发明提供了一种人多能干细胞3d分化来源的人上皮干细胞3d-hepsc，于2024年6月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.46003。

6、进一步地，相对hpsc细胞(human pluripotent stem cell，缩写hpsc)中的h9细胞系，人上皮干细胞3d-hepsc高表达标志物细胞角蛋白15、角蛋白18、转录因子p63和itga6，不表达或极低表达nanog、oct4，且极低表达cd200；

7、人上皮干细胞3d-hepsc相对原代hek细胞不表达或极低表达角蛋白14。

8、进一步地，人上皮干细胞3d-hepsc在mrna水平上的角蛋白18表达量是h9细胞系的8倍以上。

9、进一步地，人上皮干细胞3d-hepsc在mrna水平上的itga6表达量是h9细胞系的5～8倍，可选地为5～6倍。

10、进一步地，人上皮干细胞3d-hepsc在mrna水平上的角蛋白15表达量是h9细胞系的40倍以上。

11、进一步地，人上皮干细胞3d-hepsc在mrna水平上的转录因子p63表达量是h9细胞系的1000或1200倍以上。

12、进一步地，人上皮干细胞3d-hepsc在mrna水平上相对h9细胞系的nanog、oct4表达量趋近于0。

13、进一步地，人上皮干细胞3d-hepsc在mrna水平上的cd200表达量是h9细胞系的1/5或更低。

14、第二方面，本发明提供了一种用于分化获得第一方面所述的人上皮干细胞3d-hepsc的分化培养基，其包括分化培养基1或分化培养基2、或分化培养基1与分化培养基2的组合；

15、其中，分化培养基1包括：dmem培养基，并含有：20％血清替代物，1×neaa，1×glutamax，0.055mmβ-巯基乙醇，1×青霉素-链霉素双抗溶液，1～10μm视黄酸，10～50μm骨形态发生蛋白4和10μm rock抑制剂；

16、分化培养基2包括：dksfm培养基，并包含1～10μm视黄酸，10～50μm骨形态发生蛋白4(bmp4)和10μm rock抑制剂，可选地rock抑制剂为y27632。

17、进一步地，分化培养基1包括dmem培养基，并含有：20％血清替代物，1×neaa，1×glutamax，0.055mmβ-巯基乙醇，1×青霉素-链霉素双抗溶液，1μm视黄酸(ra)，25μm骨形态发生蛋白4(bmp4)和10μm rock抑制剂，可选地rock抑制剂为y27632。

18、进一步可选地，分化培养基2包括：dksfm培养基，并包含1μm视黄酸(ra)，25μm骨形态发生蛋白4(bmp4)，10μm y27632。

19、进一步可选地，分化培养基1中，血清替代物为knockout-serum replacement。

20、进一步可选地，分化培养基1中，dmem培养基为knockout dmem。

21、进一步可选地，分化培养基1中，1×neaa采用100×mem非必需氨基酸溶液稀释到dmem培养基中获得。

22、第三方面，提供一种用于分化获得第一方面所述的人上皮干细胞3d-hepsc的分化方法，包括如下步骤：

23、1)扩增培养hpsc细胞成克隆块，使细胞分散成单细胞；

24、2)将步骤1)的单细胞进行3d培养，采用eb形成培养基形成细胞团；可选地，eb形成培养基包括：dmem培养基，并含有：20％血清替代物，1xneaa，1×glutamax，0.055mmβ-巯基乙醇，1×青霉素-链霉素双抗溶液，1～10μm视黄酸和10～50μm骨形态发生蛋白4和100μm的rock抑制剂；可选地，rock抑制剂为y27632；

25、3)将步骤2)获得的细胞团进行分化；采用第二方面所述的分化培养基进行分化培养，其中，先用分化培养基1适应性分化1～2天，再用分化培养基2分化培养3～5天，转入d-ksfm培养4～6天，获得分化的人上皮干细胞3d-hepsc。

26、进一步地，步骤3)中，采用分化培养基2分化培养过程中1～2天更换一次培养基；

27、和/或，采用d-ksfm培养过程中，每20～28h更换一次培养基，可选地更换时间为24h。

28、进一步地，步骤1)中，培养板采用vitronectin包被。

29、进一步地，步骤1)中，采用hpsc培养基扩大培养。

30、进一步地，步骤1)中，当细胞传代至克隆边缘清晰、核质比高、形态均一，克隆内细胞间接触紧密状态，汇合度在60％左右，将克隆块分散重悬为细胞悬浮液，进行细胞团培养。

31、进一步地，步骤2)中，细胞团形成方法包括自聚集法、悬滴法、aggrewell法中的至少一种。

32、进一步地，步骤2)中，细胞成团过程中不移动细胞培养皿。

33、进一步地，步骤2)中，细胞团形成后，转入低吸附培养皿中；可选地，细胞团形成后，采用eb形成培养基继续培养1～2天；可选地，继续培养后将细胞团接种到胶原蛋白iv包被的孔板中，加步骤2)所述的eb形成培养基和2％ fbs培养过夜，用于分化。

34、第四方面，本发明提供了一种用于毛发再生的细胞组合物，包括人真皮毛乳头细胞(dpc)和第一方面所述的人上皮干细胞3d-hepsc或第二方面所述的分化方法获得的人上皮干细胞3d-hepsc；

35、可选地，dpc细胞和人上皮干细胞数量比为1：(1～3)，可选地为1：(2～3)。

36、第五方面，本发明提供了一种第一方面所述的人上皮干细胞3d-hepsc或第四方面所述的分化方法获得的人上皮干细胞3d-hepsc或第五方面所述的细胞组合物在制备毛发再生产品中的应用。

37、另一方面，本发明提供了一种第一方面所述的人上皮干细胞3d-hepsc或第三方面所述的分化方法获得的人上皮干细胞3d-hepsc或第四方面所述的细胞组合物在进行毛发再生的方法，向有需要的受试者施用预防或治疗有效量的上述含有人上皮干细胞3d-hepsc与dpc细胞的细胞组合物。

38、有益效果

39、本发明在研究人多能干细胞(hpsc)3d分化拟获得hek细胞的过程中，意外获得了一种不同于hek、传统毛囊来源的hepsc的新的人上皮干细胞3d-hepsc，分化获得的人上皮干细胞3d-hepsc在mrna水平上高表达上皮干细胞标志物细胞角蛋白5(krt15)、角蛋白18(k18)、p63和itga6，而不表达或低表达与hek特异性相关的标志物角蛋白14(k14)(区别于hek)和与hpsc相关的标志物oct4和nanog(安全性高，不具有潜在成瘤性)，也极低表达cd200(不同于传统的毛囊来源的hepsc)，itga6的相对表达量也远低于传统的毛囊来源的hepsc。本发明通过人多能干细胞(hpsc)可快速、稳定且高效地分化为人上皮干细胞3d-hepsc，分化时间大大缩短(分化时间仅需14～20天)，本发明获得的细胞团(eb球)能高效分化，不容易破裂或贴壁变差，分化稳定性大大提高。且本发明的人上皮干细胞3d-hepsc的以人多能干细胞(hpsc)为获取来源，获取简便，本发明获得的人上皮干细胞3d-hepsc在与dpc细胞混合移植时，能成功让裸鼠长出大量毛发，具有巨大的临床应用价值。