用于单基因遗传病相关基因检测的文库构建方法、核酸产品及试剂盒与流程

本申请涉及分子生物学，特别是涉及一种用于单基因遗传病相关基因检测的文库构建方法、核酸产品及试剂盒。

背景技术：

1、单基因遗传病是指由某种特定基因的突变引起的疾病。这些基因突变可以遗传给后代，导致患上相同的疾病或症状。单基因遗传病可根据遗传模式细分为常染色体显性遗传，如软骨发育不全；常染色体隐性遗传，如耳聋；x连锁显性遗传病、如x连锁智力障碍；x连锁隐性遗传病，如杜氏肌营养不良症；y连锁遗传病，如无精子症。目前已知单基因病有9000多种，其综合发病率高于1/100，多数单基因病致畸、致残、致死，仅5％有有效药物，且费用昂贵。

2、目前可用于单基因遗传病检测的技术有sanger测序、毛细管电泳和高通量测序。其中，sanger测序的通量有限，适合检测已知基因的变异，常作为致病基因或致病位点明确的单基因遗传病的检测手段或作为高通量测序的验证技术；毛细管电泳主要针对已明确由短串联重复序列数目异常引起的单基因遗传病；而高通量测序对目标区域或基因靶向检测主要采取的方式是：杂交捕获(液相和固相)和多重pcr。杂交捕获能够对更大的目标区域进行捕获，基于探针的杂交捕获技术较容易对探针进行优化，从而获得较好的均一性，对多种变异类型具有较好的兼容性，因此基于探针的杂交捕获技术适用于较大的基因panel，液相杂交捕获测序可适用于几kb到上百mb的基因组目标区域的检测，可检测snv，indel，cnv等变异。但是液相捕获存在实验操作繁琐、检测周期长、gc/at高含量区覆盖度低等问题，而且针对单一疾病或几个基因的检测相对而言成本较高；且基于液相杂交捕获的wes检测，检测主要集中在编码区以及剪切区。而采用多重pcr都是短扩增子引物，针对多个基因全覆盖检测需要成百上千对扩增引物，且随着检测基因或位点越多panel引物设计难度大，合成费用较高，与此同时，其存在交叉扩增、引物二聚体、竞争性扩增以及扩增不均一等问题，同时受到gc/at含量的影响。

3、因此，亟需一种能对单基因遗传病相关基因突变进行高效准确检出的相关技术和产品。

技术实现思路

1、基于此，本申请提供了一种用于单基因遗传病相关基因检测的文库构建方法、核酸产品及试剂盒，可用于同时检测多种单基因遗传病，且具有高灵敏度、高通量、低成本。

2、根据本申请第一方面，提供了一种用于检测单基因遗传病相关基因突变的核酸产品，包括用于扩增atp7b基因的长链pcr引物、用于扩增g6pd基因的长链pcr引物、用于扩增hbb基因的长链pcr引物、用于扩增pah基因的长链pcr引物、用于扩增mmachc基因的长链pcr引物、用于扩增slc26a4基因的长链pcr引物和用于扩增gjb2基因的长链pcr引物中的至少一种。

3、在其中一个实施例中，所述用于扩增atp7b基因的长链pcr引物的核苷酸序列如seq id no:1～10所示，所述用于扩增g6pd基因的长链pcr引物的核苷酸序列如seq id no:11～14所示，所述用于扩增hbb基因的长链pcr引物的核苷酸序列如seq id no:15～16所示，所述用于扩增pah基因的长链pcr引物的核苷酸序列如seq id no:17～28所示，所述用于扩增mmachc基因的长链pcr引物的核苷酸序列如seq id no:29～32所示，所述用于扩增slc26a4基因的长链pcr引物的核苷酸序列如seq id no:33～42所示，所述用于扩增gjb2基因的长链pcr引物的核苷酸序列如seq id no:43～44所示。

4、本申请的第二方面提供了上述的核酸产品在制备单基因遗传病的检测试剂盒中的应用。

5、本申请的第三方面提供了一种用于检测单基因遗传病的试剂盒，所述试剂盒包括上述的核酸产品。

6、在其中一个实施例中，所述试剂盒还包括pcr反应试剂。

7、在其中一个实施例中，所述pcr反应试剂包括pcr缓冲液、dna聚合酶、镁离子和dntps中的一种或多种。

8、在其中一个实施例中，所述试剂盒还包括dna提取试剂。

9、本申请的第四方面提供了一种用于单基因遗传病相关基因检测的文库构建方法，包括以下步骤：

10、提取待测生物样本的基因组dna；

11、以所述基因组dna为模板，采用上述的核酸产品进行pcr扩增，得到第一扩增产物；

12、以所述第一扩增产物为模板，进行第二pcr扩增，制得第二扩增产物；以及

13、根据所述第二扩增产物构建所述用于检测单基因遗传病相关基因检测的文库；

14、所述第二pcr扩增所用的引物包括通用引物和特异性引物中的至少一种。

15、在其中一个实施例中，制得第二扩增产物后，对所述第二扩增产物进行纯化，取纯化后的产物进行质检，取质检通过的产物构建所述单基因遗传病相关基因的基因文库。

16、在其中一个实施例中，所述第一pcr扩增的条件包括：94℃～96℃反应1min～3min，96℃～98℃反应10s～30s，65℃～70℃反应1min～8min，循环30次～40次。

17、本申请同时对单基因遗传病7个致病基因：atp7b、g6pd、hbb、pah、mmachc、slc26a4和gjb2基因进行捕获建库。本申请用于检测单基因遗传病相关基因突变的核酸产品可以和atp7b基因、g6pd基因、hbb基因、pah基因、mmachc基因、slc26a4基因和gjb2基因靶核酸序列更特异性、更灵敏、更准确的结合，既可以检测cds区和剪切区相关变异，也可以检测深度内含子区和utr区相关变异，还可以进行包含在扩增子里面外显子的缺失检测，同时也大幅降低了引物间交叉扩增、配对、竞争性扩增以及扩增不均一等问题，更好地解决高gc/at区域富集的问题。

18、利用pcr反应在待测dna片段两端加上接头的方法，采用两轮pcr反应成功构建单基因遗传病相关基因检测的文库，具有文库构建周期短，比对率高，均一性好，重复性好，操作简便等优点，可以为临床医生综合评估受检者的患病风险、定制个性化医疗和生活干预措施，以期显著降低单基因遗传病的风险提供指导。

技术特征：

1.一种用于检测单基因遗传病相关基因突变的核酸产品，其特征在于，包括用于扩增atp7b基因的长链pcr引物、用于扩增g6pd基因的长链pcr引物、用于扩增hbb基因的长链pcr引物、用于扩增pah基因的长链pcr引物、用于扩增mmachc基因的长链pcr引物、用于扩增slc26a4基因的长链pcr引物和用于扩增gjb2基因的长链pcr引物中的至少一种。

2.根据权利要求1所述的用于检测单基因遗传病相关基因突变的核酸产品，其特征在于，所述用于扩增atp7b基因的长链pcr引物的核苷酸序列如seq id no:1～10所示，所述用于扩增g6pd基因的长链pcr引物的核苷酸序列如seq id no:11～14所示，所述用于扩增hbb基因的长链pcr引物的核苷酸序列如seq id no:15～16所示，所述用于扩增pah基因的长链pcr引物的核苷酸序列如seq id no:17～28所示，所述用于扩增mmachc基因的长链pcr引物的核苷酸序列如seq id no:29～32所示，所述用于扩增slc26a4基因的长链pcr引物的核苷酸序列如seq id no:33～42所示，所述用于扩增gjb2基因的长链pcr引物的核苷酸序列如seq id no:43～44所示。

3.权利要求1或2所述的核酸产品在制备单基因遗传病的检测试剂盒中的应用。

4.一种用于检测单基因遗传病的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1～2任一项所述的核酸产品。

5.根据权利要求4所述的用于检测单基因遗传病的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括pcr反应试剂。

6.根据权利要求5所述的用于检测单基因遗传病的试剂盒，其特征在于，所述pcr反应试剂包括pcr缓冲液、dna聚合酶、镁离子和dntps中的一种或多种。

7.根据权利要求4～6任一项所述的用于检测单基因遗传病的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dna提取试剂。

8.一种用于单基因遗传病相关基因检测的文库构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

9.根据权利要求8所述的文库构建方法，其特征在于，制得第二扩增产物后，对所述第二扩增产物进行纯化，取纯化后的产物进行质检，取质检通过的产物构建所述单基因遗传病相关基因的基因文库。

10.根据权利要求8～9任一项所述的文库构建方法，其特征在于，所述第一pcr扩增的条件包括：94℃～96℃反应1min～3min，96℃～98℃反应10s～30s，65℃～70℃反应1min～8min，循环30次～40次。

技术总结本申请提供了一种用于单基因遗传病相关基因检测的文库构建方法、核酸产品及试剂盒，包括用于扩增ATP7B基因的长链PCR引物、用于扩增G6PD基因的长链PCR引物、用于扩增HBB基因的长链PCR引物、用于扩增PAH基因的长链PCR引物、用于扩增MMACHC基因的长链PCR引物、用于扩增SLC26A4基因的长链PCR引物和用于扩增GJB2基因的长链PCR引物中的至少一种。本申请用于检测单基因遗传病相关基因突变的核酸产品可以和ATP7B、G6PD、HBB、PAH、MMACHC、SLC26A4和GJB2基因靶核酸序列更特异性、更灵敏、更准确的结合，更好地解决高GC/AT区域富集的问题。技术研发人员：张向东,赵亚涵,汪利,胡琴,杨祖受保护的技术使用者：苏州贝康医学检验实验室有限公司技术研发日：技术公布日：2025/1/6