嗜冷的盐激活β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体D180S及其应用

本发明涉及基因工程，具体涉及一种嗜冷的盐激活β-n-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体d180s及其用途。

背景技术：

1、几丁质又可以叫壳多糖、甲壳素、甲壳质、聚乙酰氨基葡糖，由n-乙酰-d-氨基葡萄糖(n-acetyl-d-glucosamine)通过β-1,4糖苷键连接而成，其广泛存在于海洋甲壳动物外壳、软体动物内骨骼、昆虫翅膀、及藻类细胞壁内。几丁质是一类重要的多糖，具有广泛的应用价值，在自然界中的储存量巨大，属于第二大类天然高分子化合物，仅次于纤维素。

2、β-n-乙酰-d-氨基葡萄糖苷酶(glcnacases，β-n-acetyl-d-glucosaminidases，ec3.2.1.52)能够水解含n-乙酰氨基葡萄糖的低聚糖和蛋白质(zhang et al.applmicrobiol biot,2018,102(1):93–103)。内切几丁质酶将几丁质水解生成壳寡糖，β-n-乙酰氨基葡萄糖苷酶可进一步水解壳寡糖生成n-乙酰氨基葡萄糖(glcnac)。glcnac可应用于功能性食品、能源及化妆品等领域。

3、β-n-乙酰氨基葡萄糖苷酶在低温环境下活性较低，极大地限制了它的使用。嗜冷酶在0℃仍有活性，能在低温要求的生物技术领域表现出强活性，同时能提高温度以温和的条件使酶失活而控制工业生产过程；嗜盐酶可应用于海产品加工等领域，在高盐环境下加工食品还可以防止微生物的污染、节省灭菌等所消耗的能源，其受盐激活的特点也有利于通过调整盐浓度来控制催化反应。因此，开发出一种耐盐嗜盐的β-n-乙酰氨基葡萄糖苷酶有利于其在食品加工、酿造、洗涤、造纸、污水处理、环境污染等行业中的应用。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种嗜冷的盐激活β-n-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体，具有更低的最适温度，为能更好的应用于低温含盐环境要求下的生物技术领域中。

2、为了达到上述目的，本发明提供了一种嗜冷的盐激活β-n-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体d180s，该突变体d180s的氨基酸序列如seq id no.1所示，该突变体d180s在0℃有78.41％的酶活，其活性可以被卤素盐和nano3激活。本发明提供的突变体d180s可被应用与低温含盐环境要求下的生物技术领域中，包含洗涤、造纸或污水处理等行业，还可用于酿造等食品行业。

3、本发明还提供了上述突变体d180s的编码基因，该编码基因的核苷酸序列如seqid no.2所示。

4、本发明还提供了一种包含上述编码基因的重组质粒，该重组质粒选自pet系列的载体，优选pet-22b(+)。

5、本发明还提供了一种包含上述编码基因的重组菌，该重组菌选自大肠杆菌，优选自bl21(de3)。

6、本发明提供的嗜冷的盐激活β-n-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体d180s，解决了野生β-n-乙酰氨基葡萄糖苷酶低温活性差以及加盐调控活性不敏感的问题，具有以下优点：

7、本发明提供的突变体d180s与重组野生β-n-乙酰氨基葡萄糖苷酶opt-hj5nagnc相比，突变体d180s的热活性以及在不同浓度卤素盐和nano3中的活性发生了改变。突变体d180s最适温度为5℃，在低温条件下活性提高，此外，卤素盐和nano3对该酶的酶活有激活作用。纯化的重组野生酶opt-hj5nagnc的最适温度为45℃，在0℃仅有2.3％的酶活；突变体d180s的最适温度为5℃，在0℃还有78.41％的酶活。在终浓度为0.1-3.5mnacl、nabr、nano3和0.1-1m nai中分别进行酶促反应，重组野生酶opt-hj5nagnc的活性均受到不同程度的抑制，d180s的活性被不同程度地激活，其中nacl和nabr对d180s的激活作用最明显：在不含盐的体系中，d180s的比活力约为2.26u/mg，在终浓度为1.5m的nacl中，d180s的比活力最高，活性提高约234倍；在终浓度为0.5m的nabr体系中，d180s的比活力最高，活性提高约232倍；在终浓度为0.7m nano3中，d180s的比活力最高，活性提高约66倍；在终浓度为0.3m nai中，d180s的比活力最高，活性提高约29倍。此外，在终浓度为0.4m的naf体系中，d180s的比活力最高，活性提高约44倍。本发明中所测的5种阴离子对d180s的激活作用大小为cl->br->no3->f->i-。

8、本发明提供的突变体d180s可应用于低温含盐环境要求下的生物技术领域，尤其可应用于食品、酿造、洗涤、造纸、污水处理等行业，应用价值显著。在食品行业，嗜盐酶可应用于海产品加工、泡菜和酱汁制作以及咸味食品中，另外工业上还用嗜盐酯酶和脂肪酶合成不饱和脂肪酸和短链脂肪酸作为膳食补充剂；在酿造行业，嗜盐酶可应用于高盐稀态酱油发酵，发酵出来的酱油颜色好、风味突出、鲜香味足；在洗涤行业，nacl是洗涤剂的一种成分，应用在洗涤剂中的酶能在含盐条件下保持活性才能发挥作用，来源于aspergillusniger mh079049.1的嗜盐脂肪酶已经被用到洗涤剂配方中(alabdalallah etal.scientific reports,2021,11(1):19670)；在污水处理行业，nacl是高盐污水尤其是高盐食品加工废水中的主要无机盐，在高盐污水中添加嗜盐酶，可以提高污水的生物处理效率。

技术特征：

1.一种嗜冷的盐激活β-n-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体d180s，其特征在于，该突变体d180s的氨基酸序列如seq id no.1所示，该突变体d180s在0℃有78.41％的酶活，其活性可以被卤素盐和nano3激活。

2.如权利要求1所述嗜冷的盐激活β-n-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体d180s的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。

3.包含如权利要求2所述编码基因的重组质粒。

4.根据权利要求3所述的重组质粒，其特征在于，所述的重组质粒选自pet-22b(+)。

5.包含如权利要求2所述编码基因的重组菌。

6.根据权利要求5所述的重组菌，其特征在于，所述的重组菌选自大肠杆菌bl21(de3)。

7.如权利要求1所述嗜冷的盐激活β-n-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体d180s在低温含盐环境要求下的生物技术领域中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的生物技术领域包含食品、洗涤、造纸或污水处理行业。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的食品行业包含酿造。

技术总结本发明公开了一种嗜冷的盐激活β‑N‑乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体D180S及其应用，涉及基因工程技术领域。该突变体D180S的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，该突变体D180S的最适pH为6.0，最适温度为5℃，与氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的重组野生β‑N‑乙酰氨基葡萄糖苷酶相比，最适温度下降了40℃。重组野生β‑N‑乙酰氨基葡萄糖苷酶opt‑HJ5NagNC随反应体系中盐浓度升高而酶活降低，而NaCl、NaBr、NaI、NaF和NaNO<subgt;3</subgt;均能不同程度的激活D180S的活性，该突变体可应用于低温含盐环境要求下的生物技术领域，尤其可应用于食品、酿造、洗涤、造纸、污水处理等行业。技术研发人员：张蕊,宁娟,周峻沛,黄遵锡,吴倩,杨乐受保护的技术使用者：云南师范大学技术研发日：技术公布日：2025/1/6