饲料中农药、兽药和真菌毒素残留的快速检测方法与流程

本发明属于饲料检测的，具体涉及一种饲料中农药、兽药和真菌毒素残留的快速检测方法。

背景技术：

1、随着畜牧业的飞速发展，也带动了饲料产业发展。饲料的加工、储藏和运输过程中也极易受到各种真菌污染从而产生各种真菌毒素，其生产使用的农作物等原材料还存在农药残留的污染。这些农药、兽药和真菌毒素类的残留，不仅影响动物健康，也对人类健康构成威胁。通过检测，有助于确保饲料产品符合法规要求，可以防止含有禁用药物的饲料进入养殖环节，从而提高畜禽等产品的质量，利于控制耐药性发展，保护消费者健康，促进畜牧业健康发展，有助于提高我国畜禽产品的国际竞争力。

2、饲料的原材料和饲料中农药残留的检测标准方法少，基本上参照食品中农药残留检测方法或者针对特殊类型的饲料进行单独的优化改良。由于兽药种类繁多，检测方法可能无法覆盖所有可能的残留物，导致某些兽药残留物的检测被忽视。快速检测方法虽然操作简便，但在准确性和灵敏度上存在不足。真菌毒素的检测方法面临样品前处理复杂、检测灵敏度和特异性不足的问题。近年来，使用高分辨质谱技术进行饲料残留分析变得越来越流行，该技术可以监测各种潜在污染物和残留物，包括农药、兽药和天然毒素。全扫描分析理论上可以在单次分析中筛选无限数量的化合物，扫描范围广，必定损失灵敏度，尤其是大部分低限值的药物灵敏度不够，检测限达不到限量要求。

技术实现思路

1、本发明针对上述现有技术存在的不足，提供一种饲料中农药、兽药和真菌毒素残留的快速检测方法，所述快速检测方法通过优化样品提取技术，结合纳米材料辅助的检测技术，实现了对禽畜饲料中420种农药、163种兽药及其代谢物和13种真菌毒素的同时检测，提高了检测的灵敏度、准确性和速度，同时降低成本和操作复杂性，大大降低了检测工作强度，降低了检测成本，使用的试剂量少，对人和环境友好。

2、具体技术方案如下：

3、一种饲料中农药、兽药和真菌毒素残留的快速检测方法，包括如下步骤：采用甲醇、乙腈和异丙醇的混合提取液，依次在碱性条件和酸性条件下对试样进行提取，经混合、固相萃取吸附剂净化后，利用超高效液相色谱-串联质谱联用仪，在多反应监测扫描模式下检测，通过外标法或内标法定量，能够快速、准确地对饲料中420种农药、163种兽药及其代谢物和13种真菌毒素同时进行定性、定量分析；

4、所述固相萃取吸附剂包括n-乙烯基苯修饰的四氧化三铁功能化磁性纳米吸附材料和十八烷基化硅胶c18吸附剂。

5、通过采用上述技术方案，本发明采用甲醇、乙腈常规提取溶剂的基础上，加入异丙醇，增加溶剂和试样的相融性，配合酸性混合溶液和碱性混合溶液，提取饲料中更多酸碱性不同、极性不同的更多类型和种类的残留化合物，经n-乙烯基苯修饰的四氧化三铁功能化磁性纳米吸附材料和十八烷基化硅胶c18吸附剂有效净化，利用超高效液相色谱-串联质谱联用仪检测，达到充分提取、彻底净化、有效分离、高灵敏度检测的目的，实现了10分钟内同时检测饲料中420种农药、163种兽药及其代谢物和13种真菌毒素。

6、进一步，所述混合提取液为甲醇、乙腈和异丙醇等体积混合均匀，所述混合提取液中分别添加碱性调节剂和酸性调节剂，依次对试样进行提取。

7、进一步，所述碱性调节剂包括氨水，所述氨水的添加量占混合提取液体积分数的1.0%~4.0%；所述酸性调节剂包括甲酸，所述甲酸的添加量占混合提取液体积分数的0.2%~2.0%。

8、进一步，所述提取方式为酸碱溶液共同提取，试样先用含碱性调节剂的氨化混合提取液涡旋振荡进行第一次提取，再用含酸性调节剂的酸化混合提取液涡旋振荡进行第二次提取，两次提取液合并，混合均匀，得待净化提取液。

9、进一步，每次提取使用的混合提取液的用量相等，混合提取液的用量各为10.0毫升，涡旋振荡的提取时间为5分钟~10分钟。

10、进一步，所述净化包括如下步骤：首先将n-乙烯基苯修饰的四氧化三铁功能化磁性纳米吸附材料和十八烷基化硅胶c18吸附剂混合后，填于注射器式固相萃取柱中压实，使用前分别用乙腈、甲醇和待净化提取液润洗，注入空气，排空液体，然后吸取待净化提取液，过萃取柱，收集净化液，过有机滤膜。

11、进一步，所述n-乙烯基苯修饰的四氧化三铁功能化磁性纳米吸附材料和十八烷基化硅胶c18吸附剂的质量比为1：1~2。

12、进一步，每毫升待净化提取液的固相萃取吸附剂的用量为30毫克~50毫克。

13、进一步，利用超高效液相色谱-串联质谱联用仪检测时，采用核壳色谱柱，流动相a为2mm甲酸铵的水溶液（含体积分数为0.1%的甲酸），流动相b为2mm甲酸铵的甲醇溶液，采用梯度洗脱方式，流速为0.5ml/min，进样体积为2μl，进样时间为10min。

14、进一步，利用超高效液相色谱-串联质谱联用仪检测时，离子源为电喷雾电离源esi，采用极性切换正负离子同时扫描方式进行检测。

15、更进一步，一种饲料中农药、兽药和真菌毒素残留的快速检测方法，包括如下步骤：

16、（1）试样的称量：准确称取粉碎均匀的试样，若试样的水分含量小于50%，则称取2.0克，然后加3.0ml水；若试样的水分含量大于50%，则称取5.0克；

17、（2）混合提取液的配制：

18、混合提取液一的配制：先将甲醇、乙腈、异丙醇等体积混合，加入体积分数为1.0%~4.0%的氨水混合均匀，得混合提取液一；

19、混合提取液二的配制：先将甲醇、乙腈、异丙醇等体积混合，加入体积分数为0.2%~2.0%甲酸混合均匀，得混合提取液二；

20、（3）试样的提取：向称取好的试样中先加入10毫升混合提取液一，以2000~2500转每分钟涡旋振荡提取5分钟~10分钟，8000转每分钟离心5分钟~10分钟，转移上清液至刻度比色管中，剩余残渣再次加入10毫升混合提取液二重复提取，合并两次提取液，并用乙腈定容至刻度至25毫升，得待净化提取液；

21、（4）提取液的净化：首先将n-乙烯基苯修饰的四氧化三铁功能化磁性纳米吸附材料和十八烷基化硅胶c18吸附剂按照质量比1：1~2混合后，得固相萃取吸附剂，然后准确称取固相萃取吸附剂30毫克~50毫克，填于1毫升的注射器式固相萃取柱中压实备用，使用前分别用1.0毫升乙腈、1.0毫升甲醇和1.0毫升待净化提取液润洗，注入空气，排空液体，然后吸取待净化提取液1.0毫升，过萃取柱，收集净化液，过0.22μm聚四氟乙烯有机滤膜；

22、（5）超高效液相色谱-串联质谱法（uplc-ms/ms）分析：使用的分离色谱柱为cortecs premier t3核壳色谱柱，内径2.1毫米，粒径2.7微米，柱长100毫米，流动相a为2mm甲酸铵的水溶液（含体积分数为0.1%的甲酸），流动相b为2mm甲酸铵的甲醇溶液，采用梯度洗脱方式，流速为0.5ml/min，进样体积为2μl，进样时间为10min；离子源为电喷雾电离源esi，采用极性切换正负离子同时扫描，离子源温度为150℃，毛细管电压为0.5~1.5千伏，去溶剂气温度为400~450℃，去溶剂气流速为900~1100升每小时，喷雾气流速300升每小时，锥孔反吹气流速150~300升每小时，在多反应监测扫描模式下检测，通过外标法或内标法定量，对饲料中农药、兽药和真菌毒素同时进行定性、定量分析。

23、与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

24、（1）本发明采用甲醇、乙腈常规提取溶剂的基础上，加入异丙醇，增加溶剂和试样的相融性，配合酸性有机混合溶液（酸性调节剂）和碱性有机混合溶液（碱性调节剂），提取饲料中更多酸碱性不同、极性不同的更多类型和种类的残留化合物，经n-乙烯基苯修饰的四氧化三铁功能化磁性纳米吸附材料和十八烷基化硅胶c18吸附剂有效净化，核壳色谱柱的有效分离，高灵敏度极性切换正负离子同时扫描，达到充分提取、彻底净化、有效分离、高灵敏度检测的目的，实现了10分钟内同时检测饲料中420种农药、163种兽药及其代谢物和13种真菌毒素；

25、（2）本发明提供的快速检测方法定量限在0.01微克每千克到50微克每千克，模拟添加回收率76.3%～99.9%，相对标准偏差小于9.7%，方法稳健度高，通用性强，简单方便快捷，成本低，所用试剂少，对人和环境友好，属于一种环境友好的绿色化学分析方法；

26、（3）甲醇和乙腈作为常规的提取溶剂，经常被用于农兽药和真菌毒素等的提取，本发明中，异丙醇的加入增加了溶剂和试样的相融性；混合提取液中的添加剂甲酸或氨水的加入，改变了混合提取液的ph值，能够稳定目标物，增加目标物的溶解性，依次通过碱性和酸性两步提取，能够更多的提取试样中的残留农兽药和真菌毒素；

27、（4）典型的固相萃取材料有c18键合硅胶、石墨化碳黑、n-丙基乙二胺（psa）、氧化铝、高分子聚合物、多壁碳纳米管等，应用在农药残留检测、兽药残留检测中，用于吸附各种杂质和基质干扰物，还有用阴阳离子吸附剂，利用离子交换技术用于吸附特定类型的化合物，然后再利用离子强弱的变化，使得目标物得以富集和洗脱；一些专用型材料如分子印迹技术材料，受体-抗体作用机理用于捕捉提取液中某种或某类化合物，其专一性更强，但不适用于多类型的目标物的分析；

28、饲料中的基质更为复杂，各种金属离子、有机小分子聚合物、蛋白质和脂质，这些复杂的成分可能引起仪器污染、信号干扰和基质效应等一系列问题；纳米表征技术是高新材料基础理论研究与实际应用交叉融合的技术，在纳米表征技术下，磁性纳米材料的应用日显勃勃生机；

29、本发明的快速检测方法，对比上述吸附材料，发现使用经n-乙烯基苯修饰的四氧化三铁功能化磁性纳米吸附材料，能够有效吸附饲料中的金属离子、有机小分子聚合物和蛋白质，十八烷基化硅胶c18对各种饲料中的脂质有较强的吸附能力，通过添加回收使用证实，其混合的质量比为1：1~2，作为固相萃取吸附剂，使用量为30毫克~50毫克每毫升待净化提取液，净化时不会对农药、兽药和真菌毒素产生过多的吸附和干扰，同时仪器的信号干扰和基质效应能达到最低水平，满足方法正确度的要求；

30、（5）本发明的uplc-ms/ms分析使用的分离色谱柱为cortecs premier t3核壳色谱柱，是实心核颗粒与maxpeak高性能表面（hps）技术结合，与同等尺寸的全多孔颗粒相比，实心核颗粒在低柱压下可发挥更高的柱效，而maxpeak hps技术可减少典型不锈钢色谱柱中分析物与金属离子之间不必要的相互作用；通过方便、高效的方式将这两种技术结合在一个色谱柱系列中，能以更高的通量得到所有分析物的可靠数据，非常适合多种农药、兽药和真菌毒素的同时分析。