一种与绵羊饲料转化率相关的分子标记及其应用的制作方法

本发明属于绵羊分子标记的筛选与制备，具体涉及fabp7基因多态性作为一种与绵羊饲料转化率相关的分子标记及其应用。

背景技术：

1、中国发明专利(cn109554489b)一种与绵羊饲料转化率相关的分子标记及其应用，本发明提供了一种与绵羊饲料转化率相关的分子标记，以及该分子标记的检测方法和应用。本发明通过对绵羊zeb2基因进行pcr扩增和序列分析，发现在扩增片段的第645位存在一个t/c多态性位点，进一步使用pcr-rlpf对137只湖羊的多态性位点进行检测和建立最小二乘模型，对基因型和饲料转化率进行关联分析，最终确定了本发明扩增的zeb2基因片段可以作为与绵羊饲料转化率相关的分子标记，以及c等位基因为优势等位基因。本发明的分子标记可用于节粮型绵羊的选育和节粮型优质肉羊新品种的培育，为绵羊饲料转化率的遗传改良提供了基因工程手段，具有重大的实际应用价值。该专利利用限制性内切酶的特异性完成了等位基因的检测，其准确性有一定程度的保证，但其检测规模与效率大大受限，且随实验规模的扩大，其实验变量不易得到统一，实验准确性会随之下降。

2、fabp7基因在哺乳动物中的脑、肝脏、乳腺、肾脏、皮下脂肪、肌肉中均有表达(单丽玲.兔肝脏组织差异蛋白与rhdv相互作用的研究[d].北京:中国农业科学院,2014:25-26.)。fabp7基因在神经干细胞和发育中的脑星形胶质细胞中大量表达，多不饱和脂肪酸(pufas)是大脑的关键结构成分，对大脑的正常发育至关重要，pufas的细胞运输和生理作用与细胞内脂质结合蛋白基因家族编码的脂肪酸结合蛋白紧密相关，fabp7是ω-3pufa的强结合剂，表明其通过调节脂质代谢和信号转导在细胞的分化和增殖中发挥作用(owaday,yoshimoto t,kondo h.spatio-temporally differential expression of genes forthree members of fatty acid binding proteins in developing and mature ratbrains[j].j chem neuroanat,1996,2(2):113-122.)。fabp7与脂质代谢关系密切，主要功能是结合以及运输pufas，这些脂肪酸在生长早期的细胞分化、突触活化以及光感受器膜的生物合成中必不可少。在北京油鸡全基因组关联分析中，通过mlm模型和glm模型分析发现，在胸肌重、胸肌率均达到全基因组极显著水平的snp位点附近存在fabp7基因(吴丹.北京油鸡体重和屠体性状的全基因组关联研究[d].北京:中国农业科学院,2012:38-39.)，由此分析fabp7可能是影响体重以及胴体性状的候选基因。而fabp7在饲料效率性状方面的研究比较少，绵羊饲料转化率由微效多基因影响，本发明通过对fabp7基因进行测序和分析，探讨不同基因型与绵羊饲料转化率的相关性，旨在为绵羊良种选育方面提供参考依据，为我国优良绵羊品种的培育提供基因工程手段。

技术实现思路

1、本发明的目的在于设计提供一种与绵羊饲料转化率相关的分子标记及其应用的技术方案。

2、本发明的分子标记从绵羊fabp7基因中扩增得到，其具体核苷酸序列如seq idno:1所示。通过扩增绵羊fabp7基因的dna序列并测序，筛选fabp7基因的多态性位点，从而可以建立绵羊饲料转化率相关分子标记的检测方法，并可将该分子标记应用于节粮型优质肉羊新品种的培育中。

3、本发明的技术方案如下所述：

4、一方面，本发明提供了一种与绵羊饲料转化率相关的分子标记，该分子标记对通过对绵羊fabp7基因进行扩增而获得，具体的，该分子标记的核苷酸序列如seq id no.1所示，即

5、tcactattcgctcaaccattactttttgaaaaatcaatttgtttgacttccatatcagaaatctgatctgtacctattgctatgttctgcattttgttggtggtctcagtctgttgttagtctggatggagacaaacttgttcatgtacagaaatgggatggcaaagaaacaaattttgtaagagagattaaggatggcaaaatggtcatggtaagtagagcaattcccgattcctattcctgcttcttctcctacccccctcaaatttcccatttccttccttgtccctccttccctccttttctcccatctttccttttctaataacattaagtcactagcaagg

6、其中第255位的r表示a或g，由于上述序列在第255位碱基处有一个a/g突变，从而导致了绵羊fabp7基因在该位点的a/g多态性。

7、第二方面，本发明提供了一种检测上述分子标记的引物对，任何可特异性扩增本发明分子标记或包含上述多态性位点的片段的引物均适用于对该分子标记进行检测，优选地，所述检测分子标记的引物对的核苷酸序列为：

8、正向引物m-f：tcactattcgctcaaccatt(seq id no.2)；

9、反向引物m-r：ccttgctagtgacttaatgt(seq id no.3)。

10、此外，本发明的引物对可针对分子标记的正义链和反义链进行设计aqptm snp引物对，其aqptm snp引物对的核苷酸序列为：

11、用于检测allelea的正向引物a1：

12、gaaggtgaccaagttcatgctgattcctattcctgcttcttctccta(seq id no.4)；

13、用于检测alleleg的正向引物a2：

14、gaaggtcggagtcaacggattgattcctattcctgcttcttctcctg(seq id no.5)；

15、通用反向引物c：ggacaaggaaggaaatgggaaatt(seq id no.6)。

16、第三方面，本发明提供了一种检测上述分子标记的试剂盒，所述试剂盒中包含了本发明第二方面的引物对。

17、第四方面，本发明提供了一种检测与绵羊饲料转化率相关的分子标记的方法，所述分子标记的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述方法包括利用本发明的引物对或试剂盒对绵羊fabp7基因进行检测，本发明的检测方法包括如下步骤：

18、a)使用本发明的引物对或包含上述引物对的试剂盒，对绵羊基因组dna进行扩增；

19、b)对步骤a)获得的扩增产物的多态性位点进行鉴定。

20、其中，在步骤b)中，上述snp分型的方法包括但不限于直接测序法、探针法、基因芯片法、高分辨率溶解曲线法。

21、在本发明的分子标记序列和多态性位点已知的情况下，针对该多态性位点设计相应的探针，以及利用上述snp分型方法对分子标记和多态性位点进行检测均属于本领域中较为常规且成熟的技术，针对该多态性位点设计的探针也可包含于本发明的第三方面的试剂盒中。

22、更为具体的，本发明中利用上述引物对检测与绵羊饲料转化率相关分子标记的方法，包括如下步骤：

23、a)以绵羊血液为样品提取基因组dna，利用seq id no.2和seq id no.3所示的引物对绵羊fabp7基因进行pcr扩增；

24、b)对上述pcr扩增产物进行测序和序列分析，从而通过多态性位点的碱基类型确定基因型。

25、此外，本发明还涉及利用aqptm引物对检测与绵羊饲料转化率相关分子标记的方法，包括如下步骤：

26、a)以绵羊血液为样品提取基因组dna，利用seq id no.4-6所示的引物对进行高通量水浴pcr扩增；

27、b)扩增结束后，利用c1000 touchtm thermal cycler仪器检测荧光信号并查看分型结果。

28、第五方面，本发明提供了上述分子标记、引物对或试剂盒的检测方法在绵羊饲料转化率检测中的应用，通过在待测绵羊中检测本发明的分子标记，并分析多态性位点的类型。

29、第六方面，本发明提供了上述分子标记、引物对或试剂盒的检测方法在绵羊育种中的应用，通过利用本发明的引物对或试剂盒对fabp7基因进行扩增和检测，确定待测样品的基因型，并初步进行其基因型与绵羊饲料转化率之间的关联分析的应用，为绵羊的分子标记辅助选择提供了一个新的分子标记。

30、基因型与饲料转化率进行关联分析得到：消耗相同量的饲料，aa基因型个体绵羊的增重量分别大于ag基因型个体和gg基因型个体。

31、本发明的有益效果是：建立了对与绵羊饲料转化率相关的分子标记及导致多态性位点的检测方法，可确定待测绵羊的多态性位点的基因型，可用于选留基因为aa纯合型绵羊作为种羊用于育种，用以培育节粮型提高绵羊的品质，有助于提高养殖业的经济效益。

32、本专利通过检测含有荧光探针的引物扩增所产生的不同的荧光效应完成对等位基因的检测，在保证一定准确性的基础上，操作难度更低，大大提升了实验效率，且随着实验规模的扩大，实验成本也会降低，且实验的可重复性高，可验证性强。