一种维生素K1及其异构体检测和含量测定方法与流程

本发明涉及检测，具体涉及一种维生素k1及其异构体检测和含量测定方法。

背景技术：

1、维生素k1为2-甲基-1,4-萘醌的衍生物，化学式为c31h46o2，其为脂溶性维生素，呈黄色至橙色透明黏稠液体，无臭，易溶于氯仿、乙醚及植物油，微溶于乙醇，不溶于水。加热至120℃才会分解，但易受紫外线照射而破坏，故要避光保存。维生素k1主要存在于蔬菜中，如绿叶蔬菜，菠菜、羽衣甘蓝、花椰菜和卷心菜，摄入后，维生素k1可增加肠道蠕动和分泌功能，同时,它还可影响一些激素的代谢，如延缓糖皮质激素在肝中的分解。维生素k1主要作食品强化剂，多用于婴幼儿食品，使用量在420～475μg/kg之间，它也作维生素类药，用于维生素k1缺乏症、凝血酶过低症、新生儿自然出血症的防治等。维生素k1溶于线粒体膜的类脂中，起电子转移作用，可增加肠道蠕动和分泌功能，还可影响一些激素的代谢，如延缓糖皮质激素在肝中的分解，同时具有类似氢化可的松作用，长期注射可增加甲状腺的内分泌活性等。

2、现有国标液相色谱法测试技术是通过甲醇溶解后，使用含甲醇、四氢呋喃、冰醋酸、氯化锌、乙酸钠的流动相，通过c18柱和锌还原柱，在激发波长为243nm，发射波长为430nm的荧光检测器下测定维生素k1的含量，以色谱峰的保留时间定性，外标法定量，但该分析方法使用四氢呋喃，容易损坏仪器管路，降低仪器配件使用寿命，造成仪器故障。

技术实现思路

1、本发明提供一种维生素k1及其异构体检测和含量测定方法，本发明控制液相色谱法的色谱条件，采用以甲醇为流动相a，以水为流动相b，摒弃了测试过程中锌还原柱的使用步骤，进而降低了流动相配制的复杂程度，使该测试仅依靠甲醇水的等度洗脱即可实现vk1和cis-vk1的快速分离，有利于提高测试效率，降低了含强溶解性有机试剂的流动相对仪器管路和色谱柱的损伤，具有广泛的应用前景。

2、本发明解决其技术问题采用以下技术方案：

3、一种维生素k1及其异构体检测和含量测定方法，采用液相色谱法定性和/或定量检测待测样品中的维生素k1及其异构体，所述液相色谱法的色谱条件为：色谱柱为三十烷基硅烷键合硅胶色谱柱；柱温为25~40℃；检测器为紫外检测器或二极管阵列检测器；以甲醇为流动相a，以水为流动相b进行等度洗脱，流速为0.5ml/min~1.0ml/min；

4、维生素k1的异构体为维生素k1顺式异构体。

5、本发明创造性的控制液相色谱法的色谱条件，采用以甲醇为流动相a，以水为流动相b，摒弃了测试过程中锌还原柱的使用步骤，进而降低了流动相配制的复杂程度，使该测试仅依靠甲醇水的等度洗脱即可实现vk1和cis-vk1的快速分离，有利于提高测试效率，降低了含强溶解性有机试剂的流动相对仪器管路和色谱柱的损伤，具有广泛的应用前景。

6、作为本发明的优选实施方案，所述色谱柱的规格为150mm×3.0mm×2.7μm，粒径为2~3μm。

7、作为本发明的优选实施方案，所述等度洗脱时，甲醇和水的体积比为（90~99）：（1~10）。

8、作为本发明的优选实施方案，所述色谱条件还包括：进样量为5~20μl。

9、作为本发明的优选实施方案，所述色谱条件还包括：检测波长为220~280nm。

10、作为本发明的优选实施方案，所述待测样品为合生元奶粉。

11、作为本发明的优选实施方案，所述液相色谱法定性和/或定量检测具体为：

12、（1）将维生素k1与维生素k1顺式异构体用溶剂配制成对照品溶液，将对照品溶液用液相色谱仪进行测定，得到色谱图；

13、（2）将待测样品制备成供试品溶液，将供试品液相色谱仪进行测定，得到对比色谱图；

14、（3）对比色谱图与色谱图进行比对进行定性分析；

15、（4）根据峰面积，采用面积归一法定量计算维生素k1与维生素k1顺式异构体的含量。

16、其中面积归一法计算方法具体为：

17、

18、其中：ω为样品中vk1或cis-vk1的质量分数，单位为%；

19、ai为样品各组分峰面积。

20、作为本发明的优选实施方案，所述对照品溶液中维生素k1的浓度为0.05~5μg/ml，所述对照品溶液中维生素k1顺式异构体的浓度为0.05~5μg/ml。

21、作为本发明的优选实施方案，所述供试品溶液的制备方法为：（1）准确称取经均质的试样1g~5g于50ml离心管中，加入同位素内标使用液（1μg/ml）0.25ml，加入5ml温水溶解(液体样品直接吸取5ml，植物油不需加水稀释)，加入磷酸盐缓冲液（ph8.0）5ml，混匀，加入0.2g脂肪酶和0.2g淀粉酶（不含淀粉的样品可以不加淀粉酶），加盖，涡旋2min~3min，混匀后，置于35~39℃恒温水浴振荡器中振荡2h以上，使其充分酶解；

22、（2）取出酶解好的试样，分别加入10 ml 乙醇及1g碳酸钾，混匀后加入10 ml 正己烷,涡旋提取10min，6000r/min离心3min，转移上清液至另一50ml离心管中，向下层液再加入10ml正己烷，涡旋5min，6000r/min离心3min，合并上清液，正己烷定容至25ml，在上述提取液中加入20ml水，振摇0.5min，静置分层后，分取5ml上清液于10ml的玻璃试管中，氮吹至干，加入1ml甲醇溶解，用0.22μm 滤膜过滤，得到供试品溶液。

23、作为本发明的优选实施方案，所述溶剂为甲醇、乙醇中的至少一种。

24、本发明的有益效果：本发明控制液相色谱法的色谱条件，采用以甲醇为流动相a，以水为流动相b，摒弃了锌还原柱这一色谱柱的使用，进而降低了流动相配制的复杂程度，使该测试仅依靠甲醇水的等度洗脱即可实现vk1和cis-vk1的快速分离，有利于提高测试效率，降低了含强溶解性有机试剂的流动相对仪器管路和色谱柱的损伤，具有广泛的应用前景。

技术特征：

1.一种维生素k1及其异构体检测和含量测定方法，其特征在于，采用液相色谱法定性和/或定量检测待测样品中的维生素k1及其异构体，所述液相色谱法的色谱条件为：色谱柱为三十烷基硅烷键合硅胶色谱柱；柱温为25~40℃；检测器为紫外检测器或二极管阵列检测器；以甲醇为流动相a，以水为流动相b进行等度洗脱，流速为0.5ml/min~1.0ml/min；

2.根据权利要求1所述的维生素k1及其异构体检测和含量测定方法，其特征在于，所述色谱柱的规格为150mm×3.0mm×2.7μm，粒径为2~3μm。

3.根据权利要求1所述的维生素k1及其异构体检测和含量测定方法，其特征在于，所述等度洗脱时，甲醇和水的体积比为（90~99）：（1~10）。

4.根据权利要求1所述的维生素k1及其异构体检测和含量测定方法，其特征在于，所述色谱条件还包括：进样量为5~20μl。

5.根据权利要求1所述的维生素k1及其异构体检测和含量测定方法，其特征在于，所述色谱条件还包括：检测波长为220~280nm。

6.根据权利要求1所述的维生素k1及其异构体检测和含量测定方法，其特征在于，所述待测样品为合生元奶粉。

7.根据权利要求1所述的维生素k1及其异构体检测和含量测定方法，其特征在于，所述液相色谱法定性和/或定量检测具体为：

8.根据权利要求1所述的维生素k1及其异构体检测和含量测定方法，其特征在于，所述对照品溶液中维生素k1的浓度为0.05~5μg/ml，所述对照品溶液中维生素k1顺式异构体的浓度为0.05~5μg/ml。

9.根据权利要求1所述的维生素k1及其异构体检测和含量测定方法，其特征在于，所述供试品溶液的制备方法为：

10.根据权利要求7~9任一所述的维生素k1及其异构体检测和含量测定方法，其特征在于，所述溶剂为甲醇、乙醇中的至少一种。

技术总结本发明属于检测技术领域，本发明具体公开了一种维生素K1及其异构体检测和含量测定方法，所述的维生素K1及其异构体检测和含量测定方法，采用液相色谱法定性和/或定量检测待测样品中的维生素K1及其异构体，所述液相色谱法的色谱条件为：色谱柱为三十烷基硅烷键合硅胶色谱柱；柱温为25~40℃；检测器为紫外检测器或二极管阵列检测器；以甲醇为流动相A，以水为流动相B进行等度洗脱。本发明采用以甲醇为流动相A，以水为流动相B，降低了流动相配制的复杂程度，使该测试仅依靠甲醇水的等度洗脱即可实现VK1和cis‑VK1的快速分离，有利于提高测试效率，降低了含强溶解性有机试剂的流动相对仪器管路和色谱柱的损伤，具有广泛的应用前景。技术研发人员：曾伟杰,李国强,李心悦,王世站,何泽受保护的技术使用者：广州太玮生物科技有限公司技术研发日：技术公布日：2025/1/6