用于工程化改造固有样淋巴细胞的方法与流程

本发明涉及用于使用慢病毒载体将核酸引入固有样淋巴细胞(包含γδt细胞)的方法；遗传工程化固有样淋巴细胞的群或组合物；以及用于治疗或预防疾病的方法。

背景技术：

1、过继细胞疗法或转移(act)是免疫疗法的一种形式，涉及从患者或供体分离t细胞，对所述细胞进行遗传修饰和/或扩增，以及后续将其再输注回患者体内。例如，t细胞可以被工程化改造以表达肿瘤抗原特异性t细胞受体(tcr)或嵌合抗原受体(car)，以将免疫应答重定向到肿瘤细胞。

2、至今，已有大多数细胞工程方法应用于αβ t细胞，这些细胞很容易从外周血中扩增和纯化。然而，这种方法有局限性。

3、例如，使用tcr需要针对肿瘤细胞呈递的加工抗原的hla匹配tcr的鉴定，并且容易受到肿瘤免疫逃逸策略(例如mhc下调)的影响。此外，使用供体(同种异体)细胞时存在移植物抗宿主病(gvhd)的风险。虽然使用car可以消除肿瘤mhc上hla匹配和抗原呈递的需要，但仍然存在通过抗原丢失来免疫逃逸的可能性。

4、使用固有或固有样免疫淋巴细胞，例如γδ t和自然杀伤(nk)细胞，可能会带来多种潜在优势。首先，肿瘤识别和杀伤不依赖于单一抗原的表达，因为固有免疫细胞可以通过其固有受体识别广谱抗原。此特性减少因单一抗原丢失而导致免疫逃逸的机会，并为靶向缺乏明确新抗原的肿瘤提供可能。其次，固有免疫细胞以mhc非依赖性方式识别其靶细胞，从而降低同种异体反应性和gvhd的风险，并能够实现开发“现成的”同种异体疗法。

5、因此，将固有样免疫细胞的特性与工程化改造策略相结合，以增强细胞毒性和/或将细胞重定向到特定靶标，是有前景的act策略。

6、基于慢病毒的细胞疗法的临床和商业黄金标准包括vsvg假型化慢病毒。在临床和转化中使用非vsvg假型化慢病毒非常罕见，以至于很少有病毒制造商(以合同研究组织(cro)或合同开发和制造组织(cdmo)的形式)在其库中提供此类产品。这很大程度上是由于vsvg假型化慢病毒在规范的自体αβ t细胞临床应用中的广泛和成功应用。

7、尽管能够将转基因高效递送至活化的规范αβ t细胞，vsvg假型化慢病毒在转导固有样淋巴细胞(例如γδ t细胞和nk细胞)方面较差。这在很大程度上是由于固有淋巴样细胞上vsvg进入受体(低密度脂蛋白或“ldl”受体)的低表达所致。最近一份关于用于免疫疗法用途的γδ t细胞优化制备的报道建议，使用vsvg假型化慢病毒以80的感染复数(moi)转导扩增的γδ t细胞；此外，即使使用此moi，该组报道的平均转导效率也仅为20%(suttonet al., 2016, cytotherapy, 18(7): 881-892)。最近一份旨在使用vsvg假型化慢病毒优化nk细胞转导的报道，报道了病毒moi为10的活化细胞的转导效率为11.8%，并继续比较各种转导增强剂以加强这种效率，包含常用的加强剂，如vectofusin、葡聚糖和pge2。他们得出的结论是，在筛选的所有加强剂中，他汀类药物导致转导效率的增强最大，用瑞舒伐他汀得到转导效率为33.3% (gong et al., 2020, mol ther methods clin dev, 17: 634-646)。在这两种情况下，使用高病毒moi和/或转导加强剂都会对细胞产品的质量和数量造成预期成本。值得注意的是，他汀类药物被发现对nk细胞细胞毒性具有抑制性。此外，对大批量病毒(用于高moi转导)和获得转导加强剂的需求导致细胞疗法制造供应链的高成本和压力。

8、这凸显了对不损害细胞质量或数量的高效且具有成本效益的固有样淋巴细胞慢病毒转导方法的需求尚未得到满足。

技术实现思路

1、本发明提供用于使用慢病毒载体将遗传物质高效引入固有样淋巴细胞的方法，所述慢病毒载体已经用rd144-hiv嵌合包膜蛋白(也称为“rd-pro”)假型化。发明人发现，嵌合rd144-hiv假型化慢病毒在以低moi将转基因递送至受刺激的固有样淋巴细胞方面出人意料地有效，并且具有出乎意料地有利的细胞活力和增殖。如前所述，基于vsvg的转导方案可能需要高达80的moi。相比之下，嵌合rd144-hiv假型化慢病毒载体在moi低至1.25时可以实现大约70%的转导效率，因此需要显著更低的病毒滴度(多达60倍的更低病毒需求)。此外，用嵌合rd144-hiv假型化病毒进行转导，显示表现出一小部分毒性，从而产生更高水平的更健康和更有效的细胞产品。因此，本发明的方法能够实现比标准慢病毒方案更具成本效益的产品制备过程，其进一步产生质量更好的细胞。

2、本发明提供用于使用慢病毒载体将核酸引入固有样淋巴细胞的方法，其中所述慢病毒载体包含rd114-hiv嵌合包膜蛋白。

3、先前描述了使用替代的rd114衍生慢病毒假型用于γδ t细胞转导，即rd114tr假型化慢病毒(wo 2019/104269)。有趣的是(并且与我们用rd114-hiv嵌合包膜蛋白或“rd-pro”的研究发现形成对比)，与rd114tr假型化慢病毒相比，vsvg假型化慢病毒在转导后第5天导致更高的转基因表达。这暗示了并非所有rd114衍生的慢病毒包膜都像rd-pro包膜一样对固有淋巴样细胞转导赋予类似的增强作用的事实。

4、固有样淋巴细胞可以是γδ t细胞、自然杀伤(nk)细胞、自然杀伤t(nkt)细胞、恒定自然杀伤t(inkt)细胞、粘膜相关恒定t(mait)细胞、淋巴组织诱导(lti)细胞、上皮内淋巴细胞(iel)、固有淋巴样细胞(ilc)，诸如第1组固有淋巴样细胞、第2组固有淋巴样细胞、第3组固有淋巴样细胞、b1细胞、边缘区b细胞和/或表达cd8αα的细胞。

5、固有样淋巴细胞可以是γδ t细胞、自然杀伤(nk)细胞、自然杀伤t(nkt)细胞、粘膜相关恒定t(mait)细胞、淋巴组织诱导(lti)细胞、上皮内淋巴细胞(iel)、固有淋巴样细胞(ilc)，包括第1组固有淋巴样细胞、第2组固有淋巴样细胞、第3组固有淋巴样细胞、b1细胞、边缘区b细胞和/或表达cd8αα的细胞。

6、固有样淋巴细胞可以是γδ t细胞、自然杀伤(nk)细胞、恒定自然杀伤t(inkt)细胞、粘膜相关恒定t(mait)细胞、淋巴组织诱导(lti)细胞、上皮内淋巴细胞(iel)、固有淋巴样细胞(ilc)，诸如第1组固有淋巴样细胞、第2组固有淋巴样细胞、第3组固有淋巴样细胞、b1细胞、边缘区b细胞和/或表达cd8αα的细胞。

7、固有样淋巴细胞可以是γδ t细胞、自然杀伤(nk)细胞、粘膜相关恒定t(mait)细胞、淋巴组织诱导(lti)细胞、上皮内淋巴细胞(iel)、固有淋巴样细胞(ilc)，包括第1组固有淋巴样细胞、第2组固有淋巴样细胞、第3组固有淋巴样细胞、b1细胞、边缘区b细胞和/或表达cd8αα的细胞。在一些实施方案中，固有样淋巴细胞是γδ t细胞，例如vδ2+ t细胞。

8、在一些实施方案中，固有样淋巴细胞是γδ t细胞，例如vδ1+ t细胞。

9、在一些实施方案中，固有样淋巴细胞是γδ t细胞，例如非vδ1+/vδ2+ t细胞。

10、在一些实施方案中，固有样淋巴细胞是nk细胞。

11、在一些实施方案中，嵌合包膜蛋白包含rd114包膜蛋白，其中r肽切割序列被hiv-1基质/衣壳切割序列替换。

12、rd114-hiv嵌合包膜蛋白可以具有seq id no: 4的序列。

13、本发明提供用慢病毒载体以低感染复数(moi)将核酸引入固有样淋巴细胞的方法。

14、在一些实施方案中，通过本文所述的慢病毒载体以50左右、25左右、10左右、5左右、2.5左右或1.25左右的moi将核酸引入固有样淋巴细胞中。

15、在一些实施方案中，在不存在转导加强剂的情况下，通过本文所述的慢病毒载体将核酸引入固有样淋巴细胞中。

16、本发明提供将感兴趣的基因引入固有样淋巴细胞的方法。感兴趣的基因可以包含任何治疗相关的核苷酸序列。

17、例如，基因可以编码人或非人来源的免疫学或代谢活性的天然存在或合成蛋白质或嵌合分子。所编码的蛋白质可以在细胞内、在细胞膜表达或从细胞分泌。

18、在一些实施方案中，本文所述的慢病毒载体包含编码以下的基因：嵌合抗原受体(car)、嵌合共刺激受体、双car、三car、系链car、非信号传导car、截短的car、t细胞受体(tcr)、与car共表达的tcr、scfv-fc融合蛋白(sfp)、抗体、darpin、纳米抗体、三体、双体、双特异性t细胞接合器(bite)、转录因子、细胞内信号传导分子和/或介质、细胞因子、趋化因子、整合素、凝集素、粘附分子、细胞表面受体、细胞表面配体、葡萄糖转运蛋白、离子转运蛋白、近膜和/或远膜细胞内酶，例如磷酸酶、酪氨酸激酶、丝氨酸苏氨酸激酶、蛋白酶、基质金属蛋白酶和/或降解决定子。

19、本发明提供将核酸引入固有样淋巴细胞的方法，其包括以下步骤：

20、(i) 获得固有样淋巴细胞群；和

21、(ii) 将固有样淋巴细胞与慢病毒载体一起温育；

22、其中所述慢病毒载体包含rd114-hiv嵌合包膜蛋白。

23、方法可以在不存在转导增强剂的情况下进行。

24、可以从受试者中分离固有样淋巴细胞群，例如从血液或组织衍生的产品中分离。

25、本发明的方法还可以包含在用慢病毒载体温育之前和/或期间刺激，诸例如激活和/或扩增固有样淋巴细胞的步骤。

26、固有样淋巴细胞可以在唑来膦酸、白细胞介素2(il-2)、白细胞介素15(il-15)和/或抗cd3抗体的存在下被激活和/或扩增。

27、本发明提供通过本发明的方法获得的或可获得的遗传工程化固有样淋巴细胞群。

28、本发明提供组合物，诸如药物组合物，其包含根据本发明的固有样淋巴细胞群。

29、固有样淋巴细胞可以被遗传修饰，以增强其抗肿瘤特性(例如细胞毒性和细胞因子产生)、增殖、持久性、代谢适应性(例如对缺氧或葡萄糖饥饿的抗性)、区分健康组织和恶性组织的能力、抗炎特性和/或对化疗药物的抗性。

30、例如，固有样淋巴细胞可以被遗传修饰以表达嵌合抗原受体(car)、嵌合共刺激受体、双car、三car、系链car、非信号传导car、截短的car、t细胞受体(tcr)、与car共表达的tcr、scfv-fc融合蛋白(sfp)、抗体、darpin、纳米抗体、三体、双体、双特异性t细胞接合器(bite)、转录因子、细胞内信号传导分子和/或介质、细胞因子、趋化因子、整合素、凝集素、粘附分子、细胞表面受体、细胞表面配体、葡萄糖转运蛋白、离子转运蛋白、近膜和/或远膜细胞内酶，诸如磷酸酶、酪氨酸激酶、丝氨酸苏氨酸激酶、蛋白酶、基质金属蛋白酶和/或降解决定子。本发明提供治疗或预防受试者的疾病的方法，其包括向受试者施用根据本发明的固有样淋巴细胞群或组合物。

31、本发明提供根据本发明的固有样淋巴细胞群或组合物，其用于治疗或预防受试者的疾病。

32、本发明提供根据本发明的固有样淋巴细胞群或组合物，其用于免疫疗法。

33、本发明提供根据本发明的固有样淋巴细胞群或组合物在制备用于治疗或预防受试者的疾病的药物中的用途。

34、固有样淋巴细胞可以是同种异体的。

35、疾病可以是癌症；自身免疫性疾病或免疫性病理；感染性疾病，诸如细菌、真菌或病毒感染；与器官移植相关，诸如gvhd；或创伤、溃疡或脓肿。

36、下面将更详细地描述本发明的这些和其他方面以及实施方案。