一种基于昼夜节律的化妆品原料体外修护功效评估方法与流程

本发明涉及一种基于昼夜节律的化妆品原料体外修护功效评估方法，属于原料评估。

背景技术：

1、昼夜节律是指由内源性昼夜节律振荡器产生的大约24小时的生物节律，这种节律的中央起搏器位于下丘脑的视交叉上核中。时钟基因bmal1、clock、per1和per2的正反馈和负反馈回路调节人体的各种生理过程，皮肤也显示出一个复杂的昼夜节律组织。其中，clock 和 bmal1 包含时钟机制的正作用组件，而 per 和 cry 充当负调节器,bmal1、clock 驱动几个不同负反馈基因的转录，包括cry1、cry2基因和per1、per2、per3。核心成分bmal1和 clock形成异二聚体，以激活时钟控制基因 （ccg） 的转录，包括 pers和 cries，这些基因在其启动子和或增强子区域包含 e-box 元件,在周期后期，per 和 cry 蛋白通过形成复合物反过来抑制 clock-bmal1 的活性，导致 pers 和 crys 以及其他 ccg 的下调,一旦 per 和 cry 蛋白被降解，就可以开始 clock-bmal1 介导的新转录周期。

2、由于生活压力增大，生活习惯的改变，近年来熬夜人群激增，从而导致皮肤的昼夜节律紊乱，继而引发一系列皮肤问题。对人类皮肤中dna合成与一天中时间关系的研究表明，与啮齿动物皮肤相比，它在昼夜节律周期中的变异性似乎更大，下午和晚上的dna合成比早上的dna合成更多，且角质形成细胞、成纤维细胞、中性粒细胞和巨噬细胞都表现出昼夜节律，并且可能协同作用以驱动皮肤内的节律功能，这是由内源性生物钟驱动的普遍性行为和生理变化。

3、促炎因子lps会抑制巨噬细胞中的bmal1 mrna 水平， bmal1 破坏被确定为痤疮相关炎症的潜在病理因素，bmal1 二聚体还驱动昼夜节律效应基因的表达，例如编码dbp和rev-erbα 的基因，这些基因与多种生理功能有关， rev-erbα 、dbp 下调会致细胞昼夜节律的振幅并缩短其周期，rev-erbα是炎性小体的重要调节因子, rev-erbα 缺陷小鼠表现出 nlrp3 通路的激活增加，进而引发皮肤炎症，dbp是一种 par 结构域转录因子，其表达受昼夜节律控制。dbp 不仅可能是昼夜节律输出基因，而且还是昼夜节律振荡器的组成部分。同时当过表达 bmal1 时，细胞迁移能力也显着增强。然而，mirna对成纤维细胞和巨噬细胞昼夜节律特性的影响在修护方面很少受到关注，在大体组织水平上，对皮肤生理学进行昼夜节律控制，以提升机制，最大限度地减少白天对皮肤的损伤，同时促进夜间细胞的生长和修护机制是很有必要的。

4、现有的技术中，通常采用单一的细胞模型来评估化妆品原料的修护功效，有些研究只使用了人真皮成纤维细胞或人永生化角质形成细胞来评估原料的修护效果，或缺乏对不同细胞模型结果的综合分析，可能影响到评估结果的准确性和全面性。传统活性原料基于昼夜节律修护功效评价手段主要通过核心基因敲除、化学诱导、物理和饮食干预等方法，建立广泛的昼夜节律紊乱动物模型，通常实验周期长，成本高昂，对于高通量原料筛选非常不方便，还涉及到伦理问题。综上所述，现有的化妆品原料修护功效的评价方法皆有一定的技术缺陷或成本限制，尚未有适用于化妆品原料的低成本、多维度、高通量的成体系检测筛选方案，故发明一种多维度评估化妆品原料基于昼夜节律的体外修护功效评估组合方法意义重大。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种基于昼夜节律的化妆品原料体外修护功效评估方法，以解决上述背景技术中化妆品原料修护功效评估维度单一、准确度不高、实验周期长以及成本高昂的问题。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、一种基于昼夜节律的化妆品原料体外修护功效评估方法，包括以下步骤：

4、s1，hdfa人真皮成纤维细胞培养，raw264.7小鼠巨噬细胞培养；

5、s2，评估化妆品原料的溶解性，确定溶解方案，通过细胞活性检测确定化妆品原料检测浓度；

6、s3，蓝光诱导hdfa人真皮成纤维细胞，检测时钟基因bmal1和/或clock的表达量；

7、s4，制作hdfa人真皮成纤维细胞的细胞划痕后，蓝光诱导hdfa人真皮成纤维细胞，检测细胞划痕愈合面积；

8、s5，诱导药品脂多糖诱导raw264.7小鼠巨噬细胞模型，检测时钟基因dbp和/或rev-erbα表达量；

9、s6，处理并分析步骤s3的检测结果，对其进行评分；

10、s7，处理并分析步骤s4的检测结果，对其进行评分；

11、s8，处理并分析步骤s5的检测结果，对其进行评分；

12、s9，汇总步骤s6-8所有检测指标评分，求得每个样品的所有检测指标评分之和作为该样品的综合评分。

13、进一步地，步骤s3包括：取步骤s1中对数生长的hdfa人真皮成纤维细胞接种培养18h~20h，设置空白对照组、模型组及样品组，其中空白对照组及模型组加入完全培养基，样品组加入由完全培养基配置的步骤s2中确定的检测浓度的化妆品原料，培养4-6h，然后用pbs缓冲液清洗1-2次后进行蓝光照射，再加入完全培养基培养16h~18h后收集细胞，再后通过rt-pcr常规方法检测每组时钟基因bmal1和/或clock的表达情况。

14、进一步地，步骤s6包括：汇总步骤s3中各组别时钟基因bmal1和/或clock表达量测定结果，计算样品组表达量与模型组表达量的比值得到相对表达量，以相对表达量作为检测指标，并进行分析评分。

15、进一步地，步骤s4包括：在每个12孔细胞培养板正中竖直放入细胞划痕插件，将s1中对数生长的hdfa人真皮成纤维细胞接种至12孔细胞培养板培养16h~24h，然后进行蓝光照射；设置空白对照组、阳性对照组及样品组，其中空白对照组加入无血清培养基，阳性对照组加入无血清培养基配置的角质形成生长因子溶液，样品组加入由无血清培养基配置的步骤s2中确定的检测浓度的化妆品原料，在显微镜下观察0、24h划痕处的细胞生长状态，分别拍照记录，用imagej软件计算每组愈合面积。

16、进一步地，步骤s7包括：汇总步骤s4中用imagej软件计算得到的愈合面积，计算样品组的愈合率和空白对照组的愈合率，取样品组愈合率与空白组愈合率的差值为相较于空白的愈合率，以相较于空白的愈合率作为检测指标，并进行分析评分。

17、进一步地，步骤s5包括：取s1中对数生长的raw264.7小鼠巨噬细胞接种培养18h~20h，设置空白对照组、诱导对照组及样品组，其中空白对照组和诱导对照组加入完全培养基，样品组加入完全培养基配置的步骤s2中确定的检测浓度的化妆品原料，培养1h~4h，然后在诱导对照组、样品组加入诱导药品脂多糖溶液，培养16h~24h后收集细胞，通过rt- pcr常规方法检测每组时钟基因dbp和/或rev-erbα的表达情况。

18、进一步地，步骤s8包括：汇总s5中各组别时钟基因dbp和/或rev-erbα表达量测定结果，计算样品组表达量与诱导对照组表达量的比值得到相对表达量，以相对表达量作为检测指标，并进行分析评分。

19、进一步地，步骤s2中，确定化妆品原料检测浓度的方法为：分别取步骤s1中对数生长hdfa人真皮成纤维细胞和raw264.7小鼠巨噬细胞，根据mtt细胞活性实验常规方法，筛选细胞存活率为90%时对应的化妆品原料浓度作为检测浓度。

20、进一步地，所述化妆品原料包含化学品、生物制品和植物提取物。

21、进一步地，步骤s6-s8中，分析方法为：应用graphpad prism作图，结果表示为mean±sd，各组间比较采用one-way anova统计分析，所有的统计分析均为双尾。

22、本发明具有以下有益效果：

23、1、本发明提供的一种基于昼夜节律的化妆品原料体外修护功效评估方法，结合不同的细胞模型检测结果，对目标原料的修护功能进行多维评估，构建基于昼夜节律的修护功效体外评价方法，提高原料评估的准确度，评估过程快速高效。

24、2、本发明提供的一种基于昼夜节律的化妆品原料体外修护功效评估方法，不仅可以提高评估的准确性和效率，还可以为护肤品行业动物替代实验、皮肤护理产品开发和功效验证的进一步研究提供有效依据，具有重要的创新价值。

25、3、本发明提供的一种基于昼夜节律的化妆品原料体外修护功效评估方法，皮肤作为人体最大的器官，具有自我修复和再生的能力，而这一过程在夜间尤为活跃，时钟基因bmal1和clock的表达水平在一天中的不同时间会有所变化，通常在夜间达到高峰，因此，时钟基因bmal1和clock的表达水平能够更加准确的反应修复功效，提升评估准确度。