用于水体总氮检测的水样前处理试剂、总氮检测试剂盒及检测方法与流程

本发明涉及水体总氮检测，具体涉及一种用于含有尿素氮和无机氮的水体总氮检测的水样前处理试剂、总氮检测试剂盒及检测方法。

背景技术：

1、水体中总氮是指有机氮、氨氮、硝酸盐氮和亚硝酸盐氮等氮化合物中的含氮量的总和是国际公认的衡量水体富营养化程度的重要指标之一。国家生态环境部已经将总氮列为地表水和工矿企业污水排放中的主要在线测定因子。

2、总氮测定方法包括紫外分光光度法测定总氮含量、高温氧化-化学发光法测定总氮含量以及其他改良后的检测方法，例如，公开号为cn 115508179 a的中国发明专利文献公开了一种水体中总氮的检测方法，将水样中的有机氮和无机氮化合物与碱性过硫酸钾在高温高压条件下进行消解，消解反应中各种含氮化合物最终转化为硝酸盐，消解后的水样在盐酸介质中，还原剂将硝酸盐迅速还原分解，生成气态的no，no和o3反应生成激发态no2*，当激发态的no2*跃迁到基态时发射出光子，其强度与样品中的总氮含量成正比，故可以通过测定化学发光的强度来测定样品中的总氮含量。

3、在国标方法或者上述专利中运用到的过硫酸钾，往往含氮量较高，且配制过程中会因操作不当使试剂失效，不能达到标准要求，导致实验室很难对其空白背景值进行有效把控。国标过硫酸钾紫外光度法要求吸光度比值（a275/a220)*100%应小于20%，越小越好，但实际操作中常常会出现以上比值大于20%而导致测定失败且很难分析原因，且在水体环境越复杂的情况下，准确性往往受到很大的挑战。另外总氮测定使用过硫酸钾法必须有高温消解这一步，需要时刻关注实验操作的安全性。

技术实现思路

1、本技术提供一种用于水体总氮检测的水样前处理试剂、总氮检测试剂盒及检测方法，可测定水体中的尿素氮和无机总氮之和，尤其适合泳池水总氮测定以及施加尿素农田的相关河道总氮测定。

2、一种用于水体总氮检测的水样前处理试剂，包括试剂a、试剂b和试剂c；所述试剂a为定氮合金；所述试剂b为脲酶提取液；所述试剂c为酒石酸钾钠-氢氧化钠溶液，以重量百分比计，酒石酸钾钠1%-10%，氢氧化钠浓度0.1%-10%，溶剂为水；

3、所述脲酶提取液的制备包括：

4、将稳定剂与甘油混匀，然后加入豆粉，常温搅拌0.5~1.5h后于0~5℃静置20~25h，取上清液并过滤，所得滤液为所述脲酶提取液；

5、所述稳定剂、甘油和豆粉的质量比为60-100：5-50：10；

6、所述稳定剂以250ml计，包含1-10g无水柠檬酸、1-10g无水磷酸氢二钠和1-10gedta-2na，溶剂为水，ph为5-7。

7、本技术的前处理试剂中，定氮合金将水样中的无机氮（硝态氮等）转化为铵态氮，脲酶提取液将水样中的尿素氮转化为铵态氮，水样中的尿素氮和无机总氮均转化为铵态氮后与氨氮检测试剂进行显色反应，可测定水体中的尿素氮和无机总氮之和。在定量的水样中，适量的定氮合金有利于提升脲酶提取液中脲酶活性的作用，二者之间相互协同，且本技术的脲酶提取液可以在常温下保持至少1年不失去活性。

8、可选的，所述脲酶提取液的制备中，常温搅拌1h后于0~5℃静置24h。

9、可选的，所述脲酶提取液的制备中，所述稳定剂、甘油和豆粉的质量比为80-100：5-15：10。

10、可选的，所述脲酶提取液的制备中，所述稳定剂以250ml计，包含1-2g无水柠檬酸、3-6g无水磷酸氢二钠和5-10gedta-2na，溶剂为水，ph为5-7。

11、可选的，所述酒石酸钾钠-氢氧化钠溶液中，以重量百分比计，酒石酸钾钠3%-5%，氢氧化钠浓度0.1%-5%，溶剂为水。

12、最优选的，

13、脲酶提取液制作方法如下：

14、稳定剂配制：1g无水柠檬酸, 5 g无水磷酸氢二钠, 7gedta-2na，先溶于200ml纯水中，然后用氢氧化钠溶液调节ph至5-7，加纯水定容至250ml；

15、豆粉制备：黄豆用中药粉碎机打粉后，过100目筛网备用；

16、脲酶提取液配制：90g稳定剂，加入10g甘油搅拌均匀，然后加入10g豆粉搅拌1h常温提取，置于冰箱静置24h后，取上清液用500目筛网过滤，留取滤液待用。

17、酒石酸钾钠-氢氧化钠溶液中，按重量百分比计，酒石酸钾钠5%，氢氧化钠浓度4%，溶剂为水。

18、本技术还提供一种利用所述水样前处理试剂进行水体总氮检测的水样前处理方法，包括：

19、取检测水样，加入所述试剂a并混匀，然后加入所述试剂b并混匀，酶解反应4~6min，然后加入所述试剂c，混匀后反应8~12min，得前处理液。

20、可选的，以检测水样为1ml计，所述试剂a、试剂b及试剂c的加入量分别为30~60mg、100-200ul和3~5ml。

21、进一步地，以检测水样为1ml计，所述试剂a、试剂b及试剂c的加入量分别为50mg、3滴（约150ul）和4ml。

22、在定量的水样中，在含有脲酶稳定剂的情况下，适量的定氮合金有提升脲酶提取液中脲酶活性的作用，催化反应进行；但当定氮合金和脲酶比例不协调时，可能会出现尿素转化率不足或者更有甚者反而会起到抑制作用，因此，合适的试剂添加比例也是本技术前处理方法的关键之一。

23、本技术还提供一种水体中总氮的检测试剂盒，其特征在于，包括氨氮检测试剂和所述的水样前处理试剂。

24、可选的，所述氨氮检测试剂为检测浓度范围为0-20mg/l的氨氮检测试剂。

25、所述氨氮检测试剂本身可采用市售产品，例如，可选的，可采用浙江陆恒环境科技有限公司的里程为0-20mg/l的氨氮比色管/测试包中的试剂。也可采用公告号为cn112858271 b中公开的氨氮检测试剂。

26、本技术还提供一种利用所述的检测试剂盒进行水体中总氮的检测方法，包括：

27、取检测水样，加入所述试剂a并混匀，然后加入所述试剂b并混匀，酶解反应4~6min，然后加入所述试剂c，混匀后反应8~12min，得前处理液；

28、所得前处理液过滤后取滤液，按比例稀释后加入所述氨氮检测试剂，静置反应4~6min后检测620nm下的吸光度值；

29、将所得吸光度值代入标准曲线，经计算得到检测水样中的总氮浓度。

30、可选的，以检测水样为1ml计，所述试剂a、试剂b及试剂c的加入量分别为30~60mg、100-200ul和3~5 ml。进一步地，以检测水样为1ml计，所述试剂a、试剂b及试剂c的加入量分别为50mg、3滴（约150 ul）和4ml。

31、所述氨氮检测试剂的加入量按照氨氮检测试剂测氨氮时的用量进行添加即可，无特殊要求。

32、与现有技术相比，本技术至少具有如下有益效果之一：

33、（1）目前国标测定总氮的方法为过硫酸钾氧化-紫外分光光度法，但实验过程相对比较繁琐，对实验条件、试剂、器皿等的要求也较为严格。且在实际水样测定时，特别在水样氨氮占总氮较高比例时，常常出现测定的总氮值低于氨氮的情况，提示该方法在存在一定的缺陷。本法以氨氮检测试剂为基础将无机氮和尿素氮均直接转化为氨氮来测定，可以避免以上问题。

34、（2）本法可测定水体中的尿素氮和无机总氮之和，尤其适合泳池水总氮测定以及施加尿素农田的相关河道总氮测定。

35、（3）过硫酸钾氧化法存在高温高压消解过程，本法避免高温高压操作，减少实验条件限制，可以作为一款便携式携带的试剂，利于野外直接进行总氮测定。

36、（4）测试试剂的稳定性好，保质期长且可常温保存，本技术的脲酶提取液可以在常温下保持至少1年不失去活性，而常规市场购置的脲酶需要在-20℃条件下存放，很难在市场上流通。