一种利用废弃油脂生产PHA的菌株及其构建方法和应用与流程

本发明涉及合成生物学领域，特别涉及一种利用废弃油脂生产pha的菌株及其构建方法和应用。

背景技术：

1、“生物可降解塑料”作为替代传统塑料的创新材料，受到了广泛关注，并被视为塑料行业未来发展的重要方向。其中，聚羟基脂肪酸酯（pha）作为微生物合成的天然高分子材料，具备良好的生物降解性和生物相容性，成为生物材料领域的研究热点。pha不仅能够在自然环境中降解，还可以通过微生物分解为无害的小分子物质，从而减少环境污染。由于其兼具塑料的热加工性能和生物医用材料的潜力，pha材料既可以应用于环保包装领域，也可以作为医用材料，如可降解缝合线、药物释放载体等。pha的发展经历了从早期的聚3-羟基丁酸酯（phb）到更具柔韧性的聚（3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯）（p34hb），这一材料的不断进步不仅提高了其工业应用价值，也为其在医疗领域的应用提供了更多可能。

2、然而，传统发酵工艺依赖于葡萄糖、木糖等可食用的碳源，不仅导致原料成本高昂，还对粮食资源造成压力，并且在生产过程中容易产生副产物，造成环境污染。因此，如何找到更加经济高效且环保的替代碳源，成为了pha生产技术发展的关键问题。

3、废弃油脂，作为城市生活垃圾中的主要成分之一，是食用油和肉类在加工、烹饪和消费过程中产生的不可食用的残渣油脂。这些废弃油脂不仅来源广泛、产量巨大，且难以集中收集和处理。处置不当的废弃油脂会导致严重的环境问题，如土壤渗透力下降、水体污染，甚至会通过不法途径回流到食用油市场，危害人们的身体健康。因此，将废弃油脂转化为有价值的生物材料，不仅可以减少其对环境的污染，还能实现资源的高效利用。

4、在此背景下，合成生物学作为一项基于生物系统设计和优化的前沿技术，展现了巨大的应用潜力。通过对微生物代谢途径的精细改造，合成生物学能够有效地将废弃油脂等非可再生资源转化为高附加值的产品。

技术实现思路

1、针对现有技术中的缺陷，本发明提出了一种利用废弃油脂生产pha的菌株及其构建方法和应用。本发明通过对不同类型废弃油脂的筛选，深入挖掘其在盐单胞菌halomonassp. ly03

2、发酵生产pha（聚羟基脂肪酸酯）中的应用潜力。废弃油脂富含多种脂肪酸及微量营养物质，能够作为碳源替代传统的葡萄糖，在促进微生物生长的同时，有效降低生产成本，并推动废弃资源的高效利用。此外，通过合成生物学手段增强菌株的β-氧化循环途径，通过基因工程调控，进一步提升了phb（聚3-羟基丁酸酯）的产量。通过引入了从头合成4-羟基丁酸（4hb）的代谢途径，并优化了合成3-羟基丙酸（3hb）的路径，形成了协同代谢的菌株体系，有效提高了pha共聚物p34hb的产量，使其具备更广泛的工业应用前景，兼具环保和经济效益。

3、本发明提供了一种利用废弃油脂生产聚羟基脂肪酸酯的菌株，所述菌株过表达 fada- fadb- fade- fadd基因序列；其中， fada- fadb- fade- fadd基因序列如seq id no.29所示；

4、所述菌株为halomonas sp. ly02、halomonas sp. ly03、halomonas lutescensmdf-9中的任意一种；所述halomonas sp. ly02的保藏编号为gdmcc no:63381，所述halomonas sp. ly03的保藏编号为gdmcc no:63382，所述halomonas lutescens mdf-9的保藏编号为gdmcc no:61850。

5、进一步的，所述菌株还表达以下任意一项或多项：

6、（i） 4hbd基因、 sucd基因、 ogda基因和 orfz基因；

7、（ii） phac基因、 phaa基因和 phab基因。

8、本发明还提供了所述的菌株的构建方法，包括如下步骤：

9、s1：体外扩增 fada- fadb- fade- fadd基因序列，插入载体中，得到第一载体质粒；

10、s2：将s1所述的第一载体质粒导入菌株中。其中， fada- fadb- fade- fadd基因序列如seq id no.29所示。

11、本发明还提供了所述的菌株的构建方法，包括如下步骤：

12、体外扩增 fada- fadb- fade- fadd基因序列，插入载体中，得到第一载体质粒，导入菌株中；

13、还包括以下任意一项或多项步骤：

14、（i）体外扩增 4hbd- sucd- ogda- orfz基因序列，插入载体，得到第二载体质粒，导入菌株中；

15、（ii）体外扩增 phac-phaa-phab基因序列，插入载体，得到第三载体质粒，将所述第三载体质粒导入菌株中。

16、其中， 4hbd- sucd- ogda- orfz基因序列如seq id no.30所示， phac-phaa-phab基因序列如seq id no.31所示。

17、本发明还提供一种使用所述的菌株生产聚羟基脂肪酸酯的方法，包括如下步骤：将菌株活化，进行摇瓶种子培养后在发酵培养基进行发酵培养。

18、进一步的，所述发酵使用的培养基中包含碳源，所述碳源为废弃油脂，所述废弃油脂为地沟油、潲水油、煎炸废油、废弃菜籽油、海天废豆油、粗甘油、咖啡渣废油和废弃棕榈油任意一种或多种；优选地，所述废弃油脂为海天废豆油和粗甘油中的任意一种或多种。

19、进一步的，所述海天废豆油的浓度为5~30 g/l，优选为15~30 g/l。

20、进一步的，所述发酵的ph为6.5~12，优选为7~11。

21、进一步的，所述发酵的培养基中包括氯化钠，所述氯化钠的浓度为10~50 g/l，优选为30~50 g/l。

22、本发明还提供所述的菌株在发酵生产聚羟基脂肪酸酯中的应用；

23、进一步的，所述发酵使用的发酵培养基中以废弃油脂为碳源。

24、综上，与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：

25、（1）本发明成功构建了具有强化β-氧化循环途径的工程菌株，能够高效利用废弃油脂作为唯一碳源进行phb的高效生产。本发明的重组菌株不仅减少了对传统碳源如葡萄糖的依赖，大幅降低了生产成本，还通过有效转化废弃油脂为有价值的生物材料，推动了资源的循环利用。将废弃油脂资源化利用不仅减少了因废弃油脂处理带来的环境污染，还能够有效缓解资源短缺问题，具有显著的环保和经济效益。

26、（2）本发明通过优化发酵过程中的关键参数如碳源的初始浓度、发酵培养基的ph以及盐浓度，进一步提高了废弃油脂的利用率，确保工程菌株能够在最佳条件下高效代谢，提升pha的生产效率。

27、（3）在p34hb共聚物的材料体系中，4hb含量的增加能够提高材料的韧性。本发明通过在工程菌中引入了从头合成4hb代谢途径，提高了产物p34hb中4hb的比例使其物理性能更加适合于各种工业应用场景，在可持续材料开发奠定坚实的基础。