葡萄糖脱氢酶突变体pTrc99A-9及其制备方法、应用和血糖检测试纸与流程

本发明涉及生物，尤其是涉及一种葡萄糖脱氢酶突变体ptrc99a-9及其制备方法、应用和血糖检测试纸。

背景技术：

1、葡萄糖脱氢酶(glucose dehydrogenase，gdh)是一种氧化还原酶，能催化葡萄糖发生脱氢氧化反应，生成葡萄糖酸内酯。在该反应过程中，葡萄糖失去电子，传递给gdh的辅酶或辅基，生成的还原型辅基或辅酶的含量与葡萄糖的浓度成正相关，据此可以用于血糖的检测，且该检测不受一般浓度的抗凝剂、防腐剂、尿酸、胆红素等的干扰。相对于传统的god法和hk法而言，gdh法操作更简便，只需一种酶参与反应即可实现，并且既可以进行连续监测(λ＝340nm)，又可以进行终点分析，因此常用于血糖测定。

2、gdh根据所结合辅基或辅酶的不同，可以分为pqq依赖的gdh(pqq-gdh)、nad依赖的gdh(nad-gdh)和fad依赖的gdh(fad-gdh)三种。可溶表达的spqq-gdh底物专一性很差，底物谱太宽；膜结合型的mpqq-gdh系膜蛋白，表达和分离纯化都很困难，这些都严重限制了其在血糖测定方面的应用。nad-gdh由于辅基结合不牢固，需要不断添加辅基来维持其活性，也不利于血糖检测。而fad-gdh辅基结合紧密不易脱落，其次反应过程中不需要氧气的参与，因此不管是检测的准确性还是保存的长久性都优于葡萄糖氧化酶和其他辅基依赖性gdh，并且市面主流的血糖仪的使用的核心酶也是fad-依赖的葡萄糖脱氢酶，一般自开封起可使用到有效期结束。

3、不同来源的野生型fad-gdh大都存在多种底物活性，对麦芽糖，木糖，乳糖和半乳糖等仍有一定的脱氢氧化活性，专一性较差，如果血液中存在此类成分，在检测血糖时会出现假性血糖。

4、有鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明的第一目的在于提供一种葡萄糖脱氢酶(fad-gdh)突变体ptrc99a-9，该突变体稳定性好，底物特异性专一，以解决上述技术问题。

2、本发明的第二目的在于提供一种核苷酸。

3、本发明的第三目的在于提供一种载体。

4、本发明的第四目的在于提供一种细胞。

5、本发明的第五目的在于提供一种葡萄糖脱氢酶突变体ptrc99a-9的制备方法。

6、本发明的第六目的在于提供上述葡萄糖脱氢酶突变体ptrc99a-9在制备血糖检测产品中的应用。

7、本发明的第七目的在于提供一种血糖检测试纸。

8、为了实现上述目的，提出以下技术方案：

9、第一方面，本发明提供了一种葡萄糖脱氢酶突变体ptrc99a-9，所述葡萄糖脱氢酶突变体ptrc99a-9的氨基酸序列如seq id no.1所示。

10、第二方面，本发明提供了一种核苷酸，所述核苷酸包括编码上述葡萄糖脱氢酶突变体ptrc99a-9的核苷酸序列。

11、作为进一步技术方案，所述核苷酸的序列如seq id no.2所示。

12、第三方面，本发明提供了一种载体，所述载体携带所述的核苷酸。

13、作为进一步技术方案，所述载体包括质粒。

14、第四方面，本发明提供了一种细胞，所述细胞携带所述的核苷酸，或者含有所述的载体，或者表达所述的葡萄糖脱氢酶突变体ptrc99a-9。

15、作为进一步技术方案，所述细胞包括大肠杆菌和毕赤酵母。

16、第五方面，本发明提供了一种葡萄糖脱氢酶突变体ptrc99a-9的制备方法，采用上述细胞发酵得到。

17、第六方面，本发明提供了上述葡萄糖脱氢酶突变体ptrc99a-9在制备血糖检测产品中的应用。

18、第七方面，本发明提供了一种血糖检测试纸，采用葡萄糖脱氢酶法检测血糖；所述血糖检测试纸的葡萄糖脱氢酶为所述的葡萄糖脱氢酶突变体ptrc99a-9。

19、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

20、本发明提供的葡萄糖脱氢酶突变体ptrc99a-9，相较于野生型具有更好的稳定性，底物特异性更加专一，能够用于制备血糖检测产品。

技术特征：

1.一种葡萄糖脱氢酶突变体ptrc99a-9，其特征在于，所述葡萄糖脱氢酶突变体ptrc99a-9的氨基酸序列如seq id no.1所示。

2.一种核苷酸，其特征在于，所述核苷酸包括编码权利要求1所述葡萄糖脱氢酶突变体ptrc99a-9的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的核苷酸，其特征在于，所述核苷酸的序列如seq id no.2所示。

4.一种载体，其特征在于，所述载体携带权利要求2或3所述的核苷酸。

5.根据权利要求4所述的载体，其特征在于，所述载体包括质粒。

6.一种细胞，其特征在于，所述细胞携带权利要求2或3所述的核苷酸，或者含有权利要求4或5所述的载体，或者表达权利要求1所述的葡萄糖脱氢酶突变体ptrc99a-9。

7.根据权利要求6所述的细胞，其特征在于，所述细胞包括大肠杆菌和毕赤酵母。

8.权利要求1所述葡萄糖脱氢酶突变体ptrc99a-9的制备方法，其特征在于，采用权利要求6或7所述的细胞发酵得到。

9.权利要求1所述的葡萄糖脱氢酶突变体ptrc99a-9在制备血糖检测产品中的应用。

10.一种血糖检测试纸，其特征在于，采用葡萄糖脱氢酶法检测血糖；所述血糖检测试纸的葡萄糖脱氢酶为权利要求1所述的葡萄糖脱氢酶突变体ptrc99a-9。

技术总结本发明提供了一种葡萄糖脱氢酶突变体pTrc99A‑9及其制备方法、应用和血糖检测试纸，涉及生物技术领域。本发明提供的葡萄糖脱氢酶突变体pTrc99A‑9，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。该葡萄糖脱氢酶突变体，相较于野生型具有更好的稳定性，底物特异性更加专一，能够用于制备血糖检测产品。技术研发人员：王燕萍,刘洪利受保护的技术使用者：杭州旭科生物技术有限公司技术研发日：技术公布日：2025/1/13