改造人工“两步法”萜类生产途径及利用大肠杆菌高产drimane型萜类化合物

本发明涉及对生物合成方法的改进，具体涉及改造人工“两步法”萜类生产途径及利用大肠杆菌高产drimane型萜类化合物。

背景技术：

1、萜类化合物是部分来源于萜类途径的混合天然产物，主要存在于真菌、海洋生物和高等植物中，在细菌中的报道较少。其中，drimane-type merosesquiterpenoids(dmts)因其结构多样性和显著的生物特性而备受关注。迄今为止，已从天然资源中鉴定出500多种具有不同结构和强效生物活性的dmts。dmts结构的多样性赋予了它们广泛的生物活性。例如，具有drimane骨架的一系列代谢产物pyripyropenes a-r，具有胆固醇酰基转移酶(acat)抑制活性。同时drimane型天然产物如水蓼二醛具有很好的抗真菌、抗病毒等活性，目前已经作为抗菌增强剂广泛应用。

2、目前常用于合成dmts的传统手性原料(如香紫苏内酯和香紫苏醇)面临着很大挑战，如合成路线复杂，产物收率较低以及降碳带来的原子不经济性。为了应对这些挑战，研究人员不断探索并发现了其他手性构建模块，如drimane型化合物drimenol和albicanol，它们作为dmt合成中的直接drimane核心具有更高的原子经济性。

3、因此，提高drimenol和albicanol的产量，通过廉价的生产获得大量化合物对后续其功能产品开发具有重要推动作用。目前生产的drimenol和albicanol的方法有化学合成法，但是步骤繁琐，并且环境不友好。之前有研究通过异源表达获得drimenol和albicanol，如在烟叶中表达植物来源drimenol合酶phds，获得392μg/g鲜重产量，选择酿酒酵母作为底盘异源表达albicanol合酶ancc，4l发酵培养基96h只获得了8.3mg产物。萜类化合物生物合成途径有经典的mva途径和mep途径，近十年来，随着生物合成技术的发展，利用人工“两步法”合成萜类化合物逐渐受到人们的关注，“两步法”途径反应体系外源加入商业化的五碳醇化合物，经过两步磷酸化反应，即可生成萜类生物合成前体化合物异戊烯基焦磷酸dmapp和ipp，相较于经典途径的优势在于：参与的酶少，反应过程好调控，更具工业化生产应用前景。同时，对于本研究选用的两步法途径的第一步酸性磷酸酶phon，作为一个催化可逆反应的磷酸酶，已有相关研究对其催化反应的动力学进行测定，发现其磷酸化反应的km值远大于水解反应。

4、基于现有“两步法”途径发酵生成drimenol产量较低，只有15mg/l，远远达不到工业化生产应用的水平。

5、关于近年来优化“两步法”发酵生产萜类化合物的研究中，大多数集中在尝试替换不同来源的磷酸酶，比较产量最佳的磷酸酶，以及发酵条件的优化。目前还没有对两步法途径中的磷酸酶进行改造提高产量的研究。

技术实现思路

1、发明目的：本发明的目的在于首先解决了“两步法”生产drimenol体系中内源性水解酶催化效果不佳的问题，通过引入链霉菌来源的水解酶ssndh，并构建融合表达体系，通过比较不同长度的linker对产量的影响，选择最佳linker长度的融合体系，用于提高大肠杆菌体内发酵产量。

2、同时，为提高“两步法”途径第一步磷酸酶phon的磷酸化效率，设计基于电荷突变的改造和保守性进化的实验思路，筛选高产突变株，提高磷酸化反应效率，从本质上为“两步法”高产萜类化合物提供改造思路。

3、完成改造后的高产体系通过替换drimenol合酶ssdms为albicanol合酶ancc，将高产体系迁移至生产albicanol，通过优化发酵条件并进行发酵罐生产，以获得大量生产albicanol。

4、技术方案：本发明所述的改性酸性磷酸酶phon，来源于shigella flexneri的酸性磷酸酶phon的第122位氨基酸由谷氨酸转变成精氨酸，第157苏氨酸转变成赖氨酸，第160位精氨酸转变成赖氨酸，氨基酸序列如seq id no：1所示。

5、所述的改性酸性磷酸酶phon，核苷酸序列如seq id no：2所示。

6、所述的改性酸性磷酸酶phon在生物合成萜类化合物中的应用。所述的改性酸性磷酸酶phon在高产萜类化合物中的应用。所述的改性酸性磷酸酶phon在高产倍半萜类化合物中的应用。

7、一种融合水解酶，融合了来源于焦土链霉菌(streptomyces showdoensis)的ssndh蛋白和drimenol合酶ssdms，氨基酸序列如seq id no：3、5、7、9所示。

8、所述的融合水解酶，核苷酸序列如seq id no：4、6、8、10所示。

9、一种drimane型萜类化合物的生产方法，包括以下步骤：(1)原料dmaa和iso在酸性磷酸酶phon和磷酸激酶ipk的作用下生成dmapp和ipp；(2)此外还加入了异戊烯基焦磷酸异构酶(idi)，以促进dmapp和ipp之间的相互转化；(3)在fpp合成酶ispa的作用下形成法尼基二磷酸(fpp)；(4)在drimenol合成酶ssdms、水解酶的作用下生成drimenol；或者在albicanol合成酶ancc的作用下生成albicanol。

10、

11、所述的生产方法，步骤(1)所述酸性磷酸酶phon为shigella flexneri来源的磷酸酶phon或所述改性酸性磷酸酶phon。

12、所述的生产方法，步骤(4)中所述水解酶为大肠杆菌内源性的水解酶或外源性水解酶ssndh。

13、所述的生产方法，步骤(4)中所述drimenol合成酶ssdms、水解酶或可替换成所述的融合水解酶。

14、一种高效生产drimane型萜化合物的大肠杆菌，含有导入ipk(核苷酸序列如seqid no：11所示)、ispa(核苷酸序列如seq id no：12所示)、idi(核苷酸序列如seq id no：13所示)、所述改性酸性磷酸酶phon、ancc(核苷酸序列如seq id no：14所示)表达载体的大肠杆菌细胞；或者含有导入ipk(核苷酸序列如seq id no：11所示)、ispa(核苷酸序列如seqid no：12所示)、idi(核苷酸序列如seq id no：13所示)、所述改性酸性磷酸酶phon、所述融合水解酶的表达载体的大肠杆菌细胞。

15、1、本发明首次将链霉菌来源的水解酶与drimenol合酶进行融合表达，使产量从15mg/l提高到110mg/l，提高了7.3倍。

16、2、本发明首次通过理性设计及电荷和保守性改造“两步法”途径phon，产量从110mg/l提高到398.4mg/l，磷酸化效率提高3.6倍，总产量提高27倍。

17、3、本发明构建的高产体系成功迁移至生产albicanol，并通过发酵条件优化，发酵罐生产，获得了3.5g/l的产量。

18、有益效果：本发明首次将水解酶与drimenol合酶融合表达，使产量提高了7.3倍。并结合理性设计改造两步法途径phon，使其磷酸化效率进一步提高3.6倍，使drimenol产量提高27倍，从15mg/l提高到398.4mg/l，并将高产体系成功迁移至生产albicanol，获得了3.5g/l的产量。