用于工程化细胞的筛选和质量评估的多重细胞测定的制作方法

背景技术：

1、基于工程化细胞的疗法为治疗复杂疾病提供了有前景的新方法，因为细胞有能力去感测和整合广泛的信号，主动移动到特定的组织区室，并启动邻近依赖性反应，例如fischbach等人,science transl.med.,5:1797(2013)。此类基于细胞的方法提供了新颖的治疗装置，该治疗装置解决了小分子和生物制剂目前面临的障碍，诸如靶特异性差、组织区室定位不理想、缺乏个性化，以及一旦施用于患者，药物的效果在空间和时间上或响应于不断变化的临床表现进行修改的潜力有限。这些问题可以降低此类化合物的药物效用。细胞毒性淋巴细胞(cl)(诸如细胞毒性t淋巴细胞(ctl)和天然杀伤细胞(nk))是用于建造基于细胞的治疗系统的优秀平台，原因有以下几个：(i)细胞毒性淋巴细胞在颗粒酶-穿孔素途径中具有独特的递送细胞到靶细胞分子转移系统；(ii)t细胞受体(tcr)或相关的嵌合抗原受体(car)赋予细胞毒性淋巴细胞在靶向呈递主要组织相容性复合体(mhc)结合的同源抗原或在car的情况下呈递任意表面抗原的细胞群时的高度特异性；(iii)激活的细胞毒性淋巴细胞差别地表达细胞因子和组织特异性受体，使淋巴细胞能够选择性地贯穿整个身体归巢到靶组织；以及(iv)在过继细胞疗法领域中已经开发了淋巴细胞修饰和治疗性施用的实验室和临床方案，例如，restifo等人,nature reviews immunology,12:269-281(2012)。鉴于这些优势和积极的临床结果，许多基于细胞的疗法已被批准用于治疗一系列癌症和其他病症。

2、然而，随着基于细胞的疗法的成功，由于使用活生物体作为药物的复杂性，在开发、制造和质量保证方面也存在重大挑战。必须进行测试，以选择合适的细胞亚群进行工程化，并确保在制造过程的每个步骤中工程化亚群的身份、纯度或可操作性没有有害变化，例如，tanna等人,cytotherapy,21:278-288(2019)；wang等人,molecular therapy,3:16015(2016)；levine等人,molecular therapy:methods&clinical development,4:92-101(2017)。因此，细胞分析平台(包括方法和系统)的可用性将推动基于细胞的疗法的领域，该细胞分析平台用于执行与基于细胞的疗法的开发和制造相关的广泛的高度多重细胞测定。

技术实现思路

1、本发明涉及用于执行大规模多重单细胞测定(特别是用于表征为医学或工业应用(诸如基于细胞的疗法)开发的群体工程化细胞)的方法和系统。示例性单细胞测定包括但不限于细胞毒性、增殖能力、激活状态、转化细胞的载体拷贝数和插入位点分析等。

2、在一方面，本文提供了一种确定一个或多个细胞特性的方法，该方法包括：(a)合成一个或多个水凝胶室，其中该一个或多个水凝胶室中的水凝胶室包封布置在通道的表面上的细胞；(b)裂解细胞，使得该细胞的基因组dna释放到该细胞的水凝胶室中；(c)扩增细胞的基因组dna，从而获得经扩增的基因组dna；以及(d)使用经扩增的基因组dna，测量细胞的病毒拷贝数、病毒整合位点或基因组拷贝数变异。

3、在一些情况下，测量进一步包括：(i)将载体特异性引物与经扩增的基因组dna退火；(ii)延伸载体特异性引物，从而获得包括基因组dna的区段的拷贝的延伸产物；以及(iii)从区段识别载体特异性引物与基因组dna的一个或多个整合位点。在一些情况下，细胞是哺乳动物细胞，并且测量进一步包括：(i)对经扩增的基因组dna的一个或多个片段进行测序，从而获得一个或多个片段的序列；和(ii)从一个或多个片段的序列确定细胞的基因组拷贝数变异。在一些情况下，测序包括获取0.25x或更大的经扩增的基因组dna的序列覆盖度。在一些情况下，基因组拷贝数变异的确定具有3兆碱基或更高的分辨率。

4、在另一方面，本文提供了一种确定一个或多个细胞的一个或多个细胞特性的方法，该方法包括：(a)提供流体装置，该流体装置包括：(i)通道，该通道包括第一表面、一个或多个细胞以及一种或多种聚合物前体，其中一个或多个细胞布置在第一表面上或第一表面附近；(ii)空间能量调制元件，该空间能量调制元件与第一表面光学连通；以及(iii)检测器；(b)用检测器识别通道中的一个或多个细胞的位置；(c)使用空间能量调制元件，将能量投射到通道中使得投射的能量使一种或多种聚合物前体形成一个或多个室的聚合物基体壁，其中一个或多个室在由检测器识别的位置处至少部分地包封一个或多个细胞；(d)向通道加载一种或多种测定试剂；以及(e)在测定条件下温育一个或多个细胞，以从一个或多个室生成指示被一个或多个室包封的细胞的一个或多个细胞特性的信号。

5、在一些情况下，(i)一个或多个细胞特性包括增殖率，(ii)在测定条件下的温育包括在生长条件下的温育，并且(iii)该方法进一步包括：在温育后，确定至少部分地被一个或多个室包封的一个或多个细胞的增殖率。在一些情况下，增殖率的确定包括对至少部分地被一个或多个室包封的一个或多个细胞进行计数。在一些情况下，一个或多个细胞特性进一步包括细胞膜蛋白的谱，并且该方法进一步包括用抗体温育一个或多个细胞，该抗体各自对不同的细胞表面蛋白具有特异性，该不同的细胞表面蛋白的相对表达允许识别一个或多个细胞，并且此类抗体中的每一个具有不同的标记。在一些情况下，第一表面包括一个或多个捕获元件，该一个或多个捕获元件用于捕获一种或多种测定组分或者一个或多个细胞的一种或多种组分。在一些情况下，抗体中的每一个具有寡核苷酸标记，该寡核苷酸标记包括能够被一个或多个捕获元件捕获的抗体特异性条形码。

6、在一些情况下，该方法进一步包括：(i)提供寡核苷酸标记，其中该寡核苷酸标记通过易裂开键联附接到抗体；(ii)向通道加载释放试剂以切割易裂开键联，使得寡核苷酸标记被释放并且被捕获元件捕获；(iii)复制被捕获的寡核苷酸标记以产生被捕获的寡核苷酸标记的互补dna；以及(iv)对互补dna进行测序以识别被捕获的寡核苷酸标记。

7、在一些情况下，第一表面包括一个或多个捕获元件，该一个或多个捕获元件用于捕获一种或多种测定组分或者一个或多个细胞的组分，其中一个或多个细胞特性进一步包括细胞转录组，并且该方法进一步包括：(i)向通道加载裂解试剂，使得一个或多个细胞的信使rna被释放并且被一个或多个捕获元件捕获；(ii)向通道加载逆转录试剂，以复制被捕获的信使rna，从而产生互补dna；以及(iii)对互补dna进行测序。

8、在一些情况下，(i)一个或多个细胞特性进一步包括由一个或多个细胞分泌的蛋白质的谱，(ii)通道进一步包括蛋白质捕获表面，该蛋白质捕获表面包括结合由一个或多个细胞分泌的蛋白质的蛋白质亲和试剂，并且(iii)该方法进一步包括使用一定量的经标记的蛋白质检测抗体来检测由一个或多个细胞分泌的与相邻于一个或多个细胞的蛋白质捕获表面结合的蛋白质。

9、在一些情况下，(i)一个或多个细胞特性包括细胞毒性，(ii)第一表面包括布置在第一表面上的靶细胞，(iii)该方法进一步包括向通道加载效应细胞，使得效应细胞布置在第一表面上或第一表面附近，(iv)温育的步骤包括用在死细胞但不在活细胞中生成光信号(optical signal)的活体染剂温育效应细胞和靶细胞；并且(v)对一个或多个室中的每一个中的死细胞进行计数以确定被一个或多个室中的每一个包封的效应细胞的细胞毒性值。在一些情况下，第一表面包括一个或多个捕获元件，该一个或多个捕获元件用于捕获一种或多种测定组分或者一个或多个细胞的一种或多种组分。在一些情况下，一个或多个细胞特性进一步包括细胞膜蛋白的谱，并且该方法进一步包括用抗体温育一个或多个细胞，该抗体各自对不同的细胞表面蛋白具有特异性，该不同的细胞表面蛋白的相对表达允许识别细胞，并且此类抗体中的每一个具有不同的标记。在一些情况下，抗体中的每一个具有寡核苷酸标记，该寡核苷酸标记包括能够被一个或多个捕获元件捕获的抗体特异性条形码。在一些情况下，该方法进一步包括：(i)提供寡核苷酸标记，其中该寡核苷酸标记通过易裂开键联附接到抗体；(ii)向通道加载释放试剂以切割易裂开键联，使得寡核苷酸标记被释放并且被捕获元件捕获；(iii)复制被捕获的寡核苷酸标记以产生被捕获的寡核苷酸标记的互补dna；以及(iv)对互补dna进行测序以识别被捕获的寡核苷酸标记。

10、在一些情况下，第一表面包括一个或多个捕获元件，该一个或多个捕获元件用于捕获一种或多种测定组分或者一个或多个细胞的组分，其中一个或多个细胞特性进一步包括细胞转录组，并且该方法进一步包括：(i)向通道加载裂解试剂，使得一个或多个细胞的信使rna被释放并且被一个或多个捕获元件捕获；(ii)向通道加载逆转录试剂，以复制被捕获的信使rna，从而产生互补dna；以及(iii)对互补dna进行测序。在一些情况下，(i)一个或多个细胞特性进一步包括由一个或多个细胞分泌的蛋白质的谱，(ii)通道进一步包括蛋白质捕获表面，该蛋白质捕获表面包括结合由一个或多个细胞分泌的蛋白质的蛋白质亲和试剂，并且(iii)该方法进一步包括使用一定量的经标记的蛋白质检测抗体来检测由一个或多个细胞分泌的与相邻于一个或多个细胞的蛋白质捕获表面结合的蛋白质。

11、在一些情况下，一个或多个细胞特性包括一个或多个细胞的基因组dna中的一个或多个核苷酸序列的拷贝数，并且该方法进一步包括：(a)裂解一个或多个细胞以释放基因组dna；(b)扩增一个或多个核苷酸序列，从而获得一个或多个经扩增的核苷酸序列；(c)用布置在通道上的一个或多个捕获元件捕获经扩增的一个或多个核苷酸序列；(d)复制被捕获的一个或多个经扩增的核苷酸序列以产生被捕获的一个或多个经扩增的核苷酸序列的互补dna；以及(e)对互补dna进行测序以识别一个或多个核苷酸序列的拷贝数。在一些情况下，一个或多个核苷酸序列各自为条形码。在一些情况下，条形码各自包括独特分子标识符。在一些情况下，独特分子标识符识别整合到基因组dna中的病毒dna，并且在单细胞中识别的许多不同的独特分子标识符指示此类单细胞的病毒拷贝数。

12、在一些情况下，一个或多个细胞特性包括一个或多个细胞的基因组dna中的一个或多个核苷酸序列的拷贝数，并且该方法进一步包括：(a)裂解一个或多个细胞以释放基因组dna；(b)向通道加载扩增试剂，该扩增试剂生成与一个或多个核苷酸序列的拷贝数成比例的信号；以及(c)扩增一个或多个核苷酸序列以生成与一个或多个核酸序列的拷贝数成比例的光信号。在一些情况下，扩增试剂是定量pcr试剂，并且信号是光信号。在一些情况下，(i)第一表面包括桥式pcr引物，(ii)扩增试剂包括桥式pcr试剂，并且(iii)信号是由桥式pcr形成的许多簇。在一些情况下，扩增试剂包括滚环扩增试剂，并且信号是许多dna纳米球。

13、在一些情况下，一个或多个细胞随机布置在第一表面上。在一些情况下，一个或多个室中的每一个包封一个或多个细胞中的单细胞。在一些情况下，一个或多个细胞包括被载体转导的细胞，并且一个或多个细胞特性包括被载体转导的细胞的载体整合位点，并且该方法进一步包括：(a)裂解被载体转导的细胞，以将每个细胞的基因组dna释放到每个细胞的相应的室中；(b)扩增被释放的基因组dna；(c)将载体特异性引物与经扩增的基因组dna退火；(d)延伸载体特异性引物，从而获得包括基因组dna的区段的拷贝的延伸产物；以及(e)从区段识别载体特异性引物与基因组dna的一个或多个整合位点。

14、在一些情况下，一个或多个细胞是哺乳动物细胞，并且一个或多个细胞特性包括基因组拷贝数变异，并且该方法进一步包括：(a)裂解一个或多个细胞以将每个细胞的基因组dna释放到每个细胞的相应的室中；(b)扩增被释放的基因组dna；(c)对经扩增的基因组dna的片段进行测序，从而获得基因组dna片段的序列；以及(d)从基因组dna片段的序列确定每个细胞的基因组拷贝数变异。在一些情况下，测序包括获取0.25x或更大的基因组dna片段的序列覆盖度，并且基因组拷贝数变异的确定具有3兆碱基或更高的分辨率。

15、在另一方面，本文提供了一种用于测量细胞群的单细胞特性的系统，该系统包括：(a)一个或多个通道，该一个或多个通道各自包括表面、布置在表面上的多个细胞以及一种或多种聚合物前体；(b)至少一个空间能量调制元件，该至少一个空间能量调制元件与每个通道的表面光学连通；(c)至少一个检测器，该至少一个检测器与每个通道的表面光学连通并且与至少一个空间能量调制元件可操作地相关联，其中检测器被配置为检测多个细胞中的每一个并确定多个细胞中的每一个在至少一个通道的表面上的位置；以及(d)每个通道中的多个凝胶室，其中每个凝胶室包封多个细胞中的一个或多个细胞，其中通过用至少一个空间能量调制元件将光投射到通道中，使得投射的光使一种或多种聚合物前体形成凝胶室的聚合物基体壁来合成凝胶室，并且其中合成的室的位置部分地由通过检测器识别的被合成的室包封的细胞的位置来确定。

16、在一些情况下，凝胶室随机布置在表面中的至少一个上。在一些情况下，凝胶室中的每一个包封单细胞。在一些情况下，聚合物基体壁对于分子量小于3×106道尔顿的分子是可渗透的，并且对于分子量大于3×106道尔顿的分子是不可渗透的。在一些情况下，聚合物基体壁对于分子量小于3×105道尔顿的分子是可渗透的，并且对于分子量大于3×105道尔顿的分子是不可渗透的。在一些情况下，聚合物基体壁对于分子量小于3×104道尔顿的分子是可渗透的，并且对于分子量大于3×104道尔顿的分子是不可渗透的。在一些情况下，聚合物基体壁对于分子量小于3×103道尔顿的分子是可渗透的，并且对于分子量大于3×103道尔顿的分子是不可渗透的。

17、在一些情况下，凝胶室是可降解的水凝胶室。在一些情况下，凝胶室是中空的，并且包封表面的区域。在一些情况下，表面包括被配置为捕获核酸的捕获元件。

18、在另一方面，本文提供了一种确定一个或多个细胞的一个或多个细胞特性的方法，该方法包括：(a)提供流体装置，该流体装置包括：(i)通道，该通道包括第一表面、一个或多个细胞以及一种或多种聚合物前体，其中一个或多个细胞布置在第一表面上或第一表面附近；(ii)空间能量调制元件，该空间能量调制元件与第一表面光学连通；以及(iii)检测器；(b)用检测器识别通道中的一个或多个细胞的位置；(c)使用空间能量调制元件，将能量投射到通道中使得投射的能量使一种或多种聚合物前体形成一个或多个室的聚合物基体壁，其中一个或多个室在由检测器识别的位置处至少部分地包封一个或多个细胞；以及(d)对通道中的一个或多个细胞执行一项或多项测定，以确定一个或多个细胞特性，其中一个或多个细胞特性选自细胞毒性、生存力、增殖率、表型、载体拷贝数、载体整合位点、转录组和基因组拷贝数变异。在一些情况下，流体装置进一步包括多个通道，并且执行一项或多项测定包括执行多项测定，其中一项或多项测定中的每一项不同测定在多个通道中的不同通道中执行。