一种TaqMan荧光定量RT-PCR试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及分子生物，具体涉及一种taqman荧光定量rt-pcr试剂盒及其应用。

背景技术：

1、猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，prrs），是一种由猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratorysyndrome，prrsv）引起的猪繁殖障碍和呼吸系统疾病的一种急性且具有高度传染性的病毒性传染病，是我国乃至全球规模化猪场最常见的传染病之一。

2、 prrsv 有10个开放阅读框(open reading frame，orf)，包含 orf1a、 orf1b、 orf2a、orf2b、 orf3、orf4、orf5、orf5a、orf6和 orf7。其中， orf2-5 编码结构蛋白：gp2a、e、gp3、gp4、gp5、gp5a； orf6 编码基质蛋白(m)； orf7 编码病毒核衣壳蛋白(n)； orf1 蛋白可以进一步水解成16种非结构蛋白，包括 nsp1α、 nsp1β、 nsp2-6、 nsp 2n、 nsp2tf、 nsp7α、nsp7β和 nsp8-12；其中nsp2基因编码最大的非结构，在病毒复制中起着重要的作用，不同病毒株的nsp2基因长度之间存在差异，这使它成为了鉴别不同毒株的靶标之一。

3、猪繁殖与呼吸综合征中的经典型毒株（c-prrsv）、高致病型毒株（hp-prrsv）和nadc-30like型毒株（nl-prrsv）在我国广泛流传；因此，需要对经典型毒株（c-prrsv）、高致病型毒株（hp-prrsv）和nadc-30like型毒株（nl-prrsv）进行检测。

4、目前，基于 pcr原理研发了一些 prrsv检测方法，以提高检测的灵敏度和准确性。现有的prrsv检测方法包括一步法多重 pcr（one-step multiplex pcr）、实时荧光定量pcr（real-time fluorescence quantitative pcr）、巢式 pcr（nested pcr）和逆转录 pcr（reverse transcriptase pcr）。

5、在prrsv 检测方法研究中，以荧光定量 pcr 为代表的分子生物学检测技术具有灵敏度高、特异性强和时效性好的优点，应用广泛。但现有方法仍存在不足，如：检测方法能够区分hp-prrsv和c-prrsv，但不能检测prrsv-1或hp-prrsv和c-prrsv的合并感染。并且，虽然现有的taqman荧光定量 pcr检测具有灵敏度高的优点，但是，检测下限基本在102copies/μl左右。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种taqman荧光定量rt-pcr试剂盒及其应用，不仅能够同时检测出猪繁殖与呼吸综合征的三种毒株c-prrsv、hp-prrsv和nl-prrsv，且具有特异性好、灵敏度高和重复性好的优点，尤其是能够大幅度降低检测下限、提高灵敏度，三种毒株c-prrsv、hp-prrsv和nl-prrsv的检测下限在101copies/μl左右。

2、本发明通过下述技术方案实现：

3、一种taqman荧光定量rt-pcr试剂盒，所述taqman荧光定量rt-pcr试剂盒能够同时检测猪繁殖与呼吸综合征中的c-prrsv、hp-prrsv和nl-prrsv；

4、所述taqman荧光定量rt-pcr试剂盒包括分别用于检测c-prrsv、hp-prrsv和nl-prrsv的引物及探针；

5、用于检测c-prrsv的上游引物的核苷酸序列如seq id no.1所示，下游引物的核苷酸序列seq id no.2所示，探针的核苷酸序列如seq id no.3所示；

6、用于检测hp-prrsv的上游引物的核苷酸序列如seq id no.4所示，下游引物的核苷酸序列seq id no.5所示，探针的核苷酸序列如seq id no.6所示；

7、用于检测nl-prrsv的上游引物的核苷酸序列如seq id no.7所示，下游引物的核苷酸序列seq id no.8所示，探针的核苷酸序列如seq id no.9所示。

8、本发明通过对猪繁殖与呼吸综合征的三种毒株c-prrsv、hp-prrsv和nl-prrsv的nsp2 区域进行比对分析，分别设计特异性引物和探针；采用本发明试剂盒的特异性引物和探针进行taqman荧光定量rt-pcr检测时，只能扩增出三种目的基因型（c-prrsv、hp-prrsv和nl-prrsv）的特异性片段，特异性好；能够大幅度降低检测下限、提高灵敏度，三种毒株c-prrsv、hp-prrsv和nl-prrsv的检测下限在101copies/μl左右；组内和组间变异系数在0.10%~2%之间，重复性好。

9、综上，本发明的taqman荧光定量rt-pcr试剂盒不仅能够同时检测出猪繁殖与呼吸综合征的三种毒株c-prrsv、hp-prrsv和nl-prrsv，且具有特异性好、灵敏度高和重复性好的优点，尤其是能够大幅度降低检测下限、提高灵敏度。

10、在具体实施时，taqman荧光定量rt-pcr试剂盒还包括反应液，反应液包括缓冲液（2x one step rt-pcr buffer）和反转录酶（takara ex taq hs）。

11、在具体实施时，taqman荧光定量rt-pcr试剂盒还包括阳性对照标准品，阳性对照标准品包括c-prrsv质粒标准品、hp-prrsv质粒标准品和nl-prrsv质粒标准品。

12、其中，c-prrsv质粒标准品的核苷酸序列如seq id no.10所示；hp-prrsv质粒标准品的核苷酸序列如seq id no.11所示；nl-prrsv质粒标准品的核苷酸序列如seq id no.12所示。

13、在具体实施时，还包括阴性对照液，所述阴性对照液为去rna酶水（rnase freeh2o）。

14、一种taqman荧光定量rt-pcr试剂盒在猪繁殖与呼吸综合征检测中的应用，检测的毒株包括c-prrsv、hp-prrsv和nl-prrsv。

15、采用上述试剂盒进行taqman荧光定量rt-pcr检测时，rt-pcr反应程序为：预变性95 ℃，10 s；变性 95 ℃，10 s；退火延伸 55~58 ℃，30 s，40个循环。

16、在一种优选方式中，rt-pcr反应程序为：预变性 95 ℃，10 s；变性 95 ℃，10 s；退火延伸 57 ℃，30 s，40个循环。

17、采用上述试剂盒进行taqman荧光定量rt-pcr检测时，rt-pcr反应体系为：用于检测c-prrsv的上游引物和下游引物的浓度均为10 μmol/l、体积均为0.2~1.2µl，用于检测c-prrsv的探针浓度为10 μmol/l、体积为0.1~1µl；用于检测hp-prrsv的上游引物和下游引物的浓度均为10 μmol/l、体积均为0.2~1.2µl，用于检测hp-prrsv的探针浓度为10 μmol/l、体积为0.2~1.2µl；用于检测nl-prrsv的上游引物和下游引物的浓度均为10 μmol/l、体积均为0.1~0.6µl，用于检测nl-prrsv的探针浓度为10 μmol/l、体积为0.2~1.2µl。

18、在一种优选方式中，用于检测c-prrsv的上游引物和下游引物的浓度均为10 μmol/l、体积均为1.0µl，用于检测c-prrsv的探针浓度为10 μmol/l、体积为0.4µl；用于检测hp-prrsv的上游引物和下游引物的浓度均为10 μmol/l、体积均为0.6µl，用于检测hp-prrsv的探针浓度为10 μmol/l、体积为0.8µl；用于检测nl-prrsv的上游引物和下游引物的浓度均为10 μmol/l、体积均为0.2µl，用于检测nl-prrsv的探针浓度为10 μmol/l、体积为0.6µl。

19、本发明基于设计的特异性引物和探针，对rt-pcr反应体系中特异性引物和探针的浓度以及rt-pcr反应程序进行优化，设计出与试剂盒中的特异性引物和探针最匹配的rt-pcr反应程序，能够进一步降低taqman 荧光定量pcr的检测限，使三种毒株c-prrsv、hp-prrsv和nl-prrsv的检测下限在101copies/μl左右，相比现有的taqman 荧光定量 pcr的检测限为102copies/μl左右，实现了检测下限的大幅度降低，进而大幅度提高了试剂盒用于taqman 荧光定量 pcr检测的灵敏度，可以是用于猪繁殖与呼吸综合征的痕量分析，且痕量分析的准确度高。

20、本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：

21、本发明通过对猪繁殖与呼吸综合征的三种毒株c-prrsv、hp-prrsv和nl-prrsv的nsp2 区域进行比对分析，分别设计特异性引物和探针，taqman荧光定量 rt-pcr 检测法只能扩增出三种目的基因型的特异性片段，特异性好；且根据设计的特异性引物和探针，优化了rt-pcr反应体系中特异性引物和探针的浓度，并优化了rt-pcr反应程序；能够大幅度降低c-prrsv、hp-prrsv和nl-prrsv检测下限、提高试剂盒的检测灵敏度；c-prrsv、hp-prrsv、nl-prrsv 的检测下限分别在10.1、11.1、9.1 copies/μl，组内和组间变异系数在0.10%~2%之间，重复性好。