基于基因甲基化检测实现人T淋巴细胞计数的试剂盒的制作方法

本发明涉及分子生物学领域，特别涉及基于基因甲基化检测实现人t淋巴细胞计数的试剂盒。

背景技术：

1、淋巴细胞是人体抵御疾病、激起免疫应答功能的重要细胞成分，其在分化成熟过程中会表达分化抗原，即cd分子。根据表达cd分子的不同，淋巴细胞亚群主要包括t淋巴细胞、b淋巴细胞和nk细胞。t淋巴细胞起源于骨髓，然后转移到胸腺中发育成熟。t淋巴细胞的特征标记物包括cd3和t细胞受体（tcr），根据功能和表面分子不同，主要可分为cd4+ t细胞、cd8+ t细胞等其他类型。

2、淋巴细胞不同亚群的比例、数量以及功能会直接影响机体的免疫状态，“淋巴细胞亚群”检测是评估机体当下免疫功能和平衡状态的重要指标，尤其对于免疫功能缺陷患者，是必不可少的诊断项目。正常情况下，淋巴细胞各亚群保持一定的比例和数量，协同合作，维持着机体的稳态。而在疾病过程中，免疫细胞的比例和数量会发生病理性的变化，导致免疫功能紊乱。淋巴细胞计数的应用场景广泛，主要可包括感染和恶性肿瘤患者淋巴细胞亚群总量异常的早期筛查，原发性免疫缺陷筛查后验证，慢性淋巴细胞白血病（cll）的辅助诊断，hiv阳性患者治疗后检测监测，免疫和免疫重建监测，如移植、自身免疫和其他免疫状况的免疫抑制治疗后及造血干细胞移植后免疫重建的评估等。

3、目前流式细胞术（flow cytometry，fcm）是淋巴细胞亚群或是t淋巴细胞计数的标准方法，它是利用不同单克隆抗体与淋巴细胞表面的cd抗原结合，再配合多色荧光染料，同时检测几种淋巴细胞的表面抗原，将t淋巴细胞从白细胞中分开，从而得到t淋巴细胞的数量和相对比例。流式细胞术进行t淋巴细胞计数存在以下几方面的局限：其一，对样本的要求较高，待检测的细胞须是完整的，血样要求“新鲜”，一般要求在8小时内进行检测；其二，由于流式t淋巴细胞对样本的要求较大，对于某些应用场景如婴幼儿的采血问题较大；其三，流式细胞术是检测荧光标记的抗体结合细胞表面的抗原后复合物的荧光信号，需要确定阴阳性复合物之间的阈值，但对于不同细胞亚群的表面抗原来说，其表达不是有或无的过程，而是低、中、高不同的表达水平，因此，t淋巴细胞亚群可能由于阈值确定去准确而导致计数不准；其四，由于样本、免疫学检测技术和操作过程的差异，各实验室检测结果差异较大，流式t淋巴细胞计数的标准化仍然是一个挑战，标准化方案有待建立。

4、在t淋巴细胞的分化发育过程中，dna甲基化修饰发挥了重要作用，通过调节基因的表达和关闭，从而提供了t淋巴细胞的特异性的甲基化标志物，如某些参与t淋巴细胞分化发育的基因启动子区，在t淋巴细胞中完全未甲基化，而在淋巴细胞之外的其他淋巴细胞亚群中高度甲基化，如b淋巴细胞、nk细胞和非淋巴细胞如粒细胞和单核细胞。这些未甲基化的cpg位点可以作为特异性的差异甲基化区域（dmr），即作为生物标志物，用来鉴定t淋巴细胞，并用于外周血中t细胞的定量。这种t淋巴细胞的特征不是通过细胞形态或表面标记物，而是通过表观遗传学手段，有望克服上述流式检测方法的局限性。

技术实现思路

1、为了克服上述问题，本发明提供一种基于基因甲基化检测实现人t淋巴细胞计数的试剂盒，所述试剂盒是检测样本中bcl11b基因甲基化的试剂盒。

2、在一种实施方式中，所述试剂盒是用于检测bcl11b基因上差异性甲基化区域hg38chr14: 99189637-99188739中片段的试剂盒。

3、在一种实施方式中，所述试剂盒是用于检测bcl11b基因上差异性甲基化区域hg38chr14: 99189331-99189185的试剂盒。

4、在一种实施方式中，所述试剂盒是用于检测包含bcl11b基因上差异性甲基化位点hg38 chr14: 99189256，hg38 chr14: 99189339，hg38 chr14: 99189410和hg38 chr14:99189483中至少一个的基因区域的试剂盒。

5、在一种实施方式中，所述试剂盒通过检测内参基因和bcl11b基因的拷贝数，从而计算出人的t细胞占人的白细胞比例。

6、在一种实施方式中，所述内参基因是rpp30基因。

7、在一种实施方式中，所述试剂盒是测序试剂盒、定量pcr试剂盒或数字pcr试剂盒。

8、在一种实施方式中，所述试剂盒包括：用于检测hg38 chr14: 99189331-99189185的区域中的cpg位点甲基化状态的引物和探针以及用于检测内参基因拷贝数的引物和探针。

9、在一种实施方式中，所述试剂盒包括：上游引物seq id no.4:ggtagtttggttgtgtatttgggtattt，下游引物seq id no . 5:aacctacaacacttctacaacactttac ，和探针seq id no . 6: ctaccaaaacataatcat。

10、在一种实施方式中，所述样本选自体液，组织样品和器官样品。

11、在一种实施方式中，其中所述样本选自外周血样品、毛细管血样品或静脉血样品或其亚组分、外周血单核细胞，血块和干血斑。

12、基于以上现状，为了克服当前基于细胞学t淋巴细胞计数的技术局限性，并扩大其适用性，本发明首先提出了bcl11b基因未甲基化基因区可作为t淋巴细胞鉴定的生物标志物。

13、甲基化芯片中cpg位点的β值代表甲基化程度，比较各组样本间相应cpg点的β差值（δβ值）可以筛选差异性甲基化位点，δβ值的绝对值越大，表明该位点甲基化程度差异越大，位点的特异性越强。本发明在以上述原则筛选t淋巴细胞差异性cpg位点时，创造性设置另外一筛选条件：甲基化芯片中相邻的4-5个cpg位点的δβ值都尽可能大，同时这几个位点是连续的，且尽可能密集，这样能保证由这4-5个甲基化位点构成的基因片段具备最大的特异性，从而满足潜在生物学标志物的需要。按此筛查条件，本发明最终确定了bcl11b基因上δβ值较大且分布相对密集的4个差异性甲基化位点：cg07015803（hg38 chr14:99189256）、cg16452866（hg38 chr14: 99189339）、cg04712122（hg38 chr14: 99189410）和cg16147511（hg38 chr14: 99189483）。

14、鉴于对基因发挥调控作用或是用于甲基化检测的是一段基因序列，须由上述筛查的差异性甲基化位点再确定一段差异性甲基化区域（dmr），用作区分t淋巴细胞的特异性标志物。同时，甲基化芯片中探针覆盖的cpg位点也非连续，本发明以筛选的4个差异性甲基化位点为基点，通过亚硫酸氢盐转化和pcr扩增后的sanger测序，验证在其前后约500bp的序列中所含的44个cpg位点的甲基化状态，在t淋巴细胞中这些位点均为未甲基化状态，而在其它亚群中这些cpg位点均为甲基化状态，与筛查出的4个差异性甲基化位点的甲基化状态完全一致，从而确定了一段约900bp由44个甲基化位点构成的差异性甲基化区域（hg38chr14: 99189637-99188739），作为t淋巴细胞的特异性未甲基化区域。

15、在上述验证的约900bp差异性甲基化区域中，选择cpg位点相对集中，同时覆盖不同甲基化位点的多个扩增子检测片段，如amp9543、amp8974和amp9324，设计相应甲基化转化后片段的引物和探针，通过荧光定量pcr（qpcr）结果比较候选扩增子的δct值（ct阴性-ct阳性），δct值越高，表明针对t淋巴细胞的特异性越好，从而优选出bcl11b基因上对应扩增子amp9324的一段147bp的差异性甲基化区域（hg38 chr14: 99189331-99189185），具有更好的特异性和灵敏度，可作为t淋巴细胞鉴定的生物标志物。

16、本发明所采用的技术方案是：首先，对待测样本的gdna进行提取，提取后的gdna经亚硫酸氢盐转化后作为dna模板。然后，使用bcl11b靶基因的扩增子特异的引物探针以及内参基因rpp30特异的引物探针，进行双重qpcr扩增。扩增反应在qpcr仪器上运行，扩增结果以荧光曲线的形式给出，选取纯化的t淋巴细胞为参照体系，依据扩增曲线和2-δδct的方法，可计算得出t淋巴细胞在白细胞中的相对含量。此外，也可采用数字pcr检测平台，直接通过检测bcl11b靶基因和rpp30内参基因的拷贝数，依据内参基因拷贝数和细胞数的对应关系（rpp30的拷贝数：细胞数=2：1），利用公式：t淋巴细胞的相对含量（%）= bcl11b靶基因的拷贝数/内参基因的拷贝数╳100，可计算出t淋巴细胞在白细胞中的相对含量。本发明所选的rpp30内参基因检测片段，在所有白细胞中稳定表达，且序列中的胞嘧啶均为未甲基化状态。

17、本发明检测的靶标是样本中白细胞dna的甲基化水平，能适用各种类型的样本，包括新鲜或冷冻的血液、分离的pbmc细胞、干血斑等，对样本的要求大大降低，对样本的保存状态没有要求；其次，dna扩增检测对样本的需求量少，微量dna可以满足检测要求；再者，通过pcr获得的检测信号是数字的，它们表示每个细胞一个阳性或阴性值，而不是像流式细胞术方法那样任意定义的“阳性”阈值；最后，基于表观遗传qpcr能够以自动化、独立于操作者的方式进行，并降低对试剂变异性的敏感性。本发明试剂盒不仅是传统流式细胞学检测的有益补充，还可服务于新生儿重症联合免疫缺陷（scid）筛查。