一种基于RT-RAA/CRISPR-Cas13a/LFD检测通用型禽流感病毒的核酸分子组合物、试剂、试剂盒及应用

本发明涉及分子生物学，更具体地说，它涉及一种基于rt-raa/crispr-cas13a/lfd检测通用型禽流感的核酸分子组合物、试剂、试剂盒及应用。

背景技术：

1、禽流感病毒(aiv)近年来在世界范围内流行，给养鸡业造成了巨大的经济损失。更重要的是，禽流感病毒能够在哺乳动物之间进行跨物种传播，对人类健康和安全构成潜在的重大威胁。

2、禽流感病毒(aiv)属于甲型流感病毒，根据禽流感病毒血凝素(ha)和神经氨酸酶(na)蛋白抗原性的不同，可分为18种ha亚型(h1-h18)和11种na亚型(n1-n11)。理论上，它们可以组合成198种不同的亚型。这些亚型在病毒的致病性、传播能力等方面可能存在差异。例如，h5n1、h7n9等亚型是对人类健康和家禽养殖业危害较大的高致病性禽流感亚型。

3、目前，核酸检测技术是应用于禽流感病毒检测比较广泛的方法，主要是通过聚合酶链式反应(pcr)技术。首先提取样本中的病毒核酸，然后利用特异性的引物对禽流感病毒的基因片段(如ha或na基因)进行扩增。如果样本中存在禽流感病毒核酸，经过pcr扩增后，通过凝胶电泳、荧光定量pcr等方法可以检测到相应的核酸片段。荧光定量pcr技术不仅可以检测病毒核酸的存在，还可以对病毒核酸的含量进行定量分析，这对于评估病毒的感染程度和传播风险等有重要意义。这种方法灵敏度高、特异性强，能检测出低浓度的病毒，但需要专业的设备和技术人员，且检测成本相对较高。

4、对于通用型禽流感病毒，目前还没有一种同时具备灵敏度高、特异型好、且适用于临床的低成本检测方法。

技术实现思路

1、为了解决现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种基于rt-raa/crispr-cas13a/lfd检测通用型禽流感病毒的核酸分子组合物，利用本发明提供的核酸分子组合物可实现通用型禽流感病毒的可视化检测，且检测准确度高，用时短，特异性好、灵敏度高，为快速、简便且准确地诊断通用型禽流感病毒提供了基础，满足临床检测的需求。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、一种基于rt-raa/crispr-cas13a/lfd检测通用型禽流感病毒的核酸分子组合物，包括上游引物raa-m-f、下游引物raa-m-r和特异性crrna-m；

4、所述上游引物raa-m-f的序列为：5'-aagtgatcctctcgttattgccgcaagtat-3'(seqid no:1)，

5、所述下游引物raa-m-r的序列为：5'-ctctgctgttcctgccggtactcttccctc-3'(seqid no:2)，

6、所述特异性crrna-m的序列为：5'-gauuuagacuaccccaaaaacgaaggggacuaaaacaagaaaagacgaucaagaauccacaaua-3'(seq id no:3)。

7、本发明将rt-raa技术、crispr-cas13a系统和侧向层析技术进行整合，建立crispr-lfd核酸检测方法。在基因序列保守区域内设计特异性crispr-crrna和rt-raa引物组，用于通用型禽流感病毒检测。将crispr检测中的荧光信号转变为直观易读的信号，通过侧向层析试纸条实现结果的快速读取，消除了对特殊设备依赖。该方法的检测灵敏度为10copies/μl，且不与其它禽类疾病病原体发生交叉反应。在临床样品的检测中，该技术同样能在1h内完成检测，且检测结果与病毒分离鉴定及荧光定量pcr方法的符合率较高。

8、优选地，将上述核酸分子组合物制成用于检测通用型禽流感病毒的试剂或试剂盒，含有上述核酸分子组合物的试剂或试剂盒均属于本发明的保护范围。

9、优选地，上述试剂盒还包含有lwacas13a蛋白和用于raa扩增的试剂。

10、本发明还提供一种利用前述的核酸分子组合物检测通用型禽流感病毒的方法，其包括以下步骤：

11、s1：提取病毒核酸模板，用上游引物raa-m-f和下游引物raa-m-r组成的引物组对病毒核酸模板进行raa扩增；

12、s2：将raa扩增产物加入crispr-cas13a体系中进行孵育，所述crispr-cas13a体系包括特异性crrna-m；

13、s3：利用lfd对crispr-cas13a的孵育产物进行检测。

14、优选地，步骤s1中的raa扩增体系包括：a buffer29.4μl、上游引物(10μm)2μl、下游引物(10μm)2μl、核酸模板2～14.1μl、b buffer2.5μl，dnase/rnase-free wate补足至50μl。

15、优选地，步骤s1中的raa扩增体系在42℃下反应30min。

16、优选地，步骤s2中的crispr-cas13a体系包括：lwacas13a蛋白(15μg/ml)0.5μl、crrna(100μmol/l)0.2μl、探针(50μmol/l)1.28μl、t7 rna polymerase 1.0μl、ntp buffermix 0.2μl、murine rnase inhibitor

17、(40u/μl)1.0μl、10×cas13a reaction buffer 2.0μl、10×t7 rna polymerasebuffer 2.0μl、cdna(100ng)0.6μl、dnase/rnase-free water补足至20.0μl。

18、进一地，步骤s2中的孵育温度为37℃，孵育时间为20min。

19、进一步地，利用lfd对crispr-cas13a孵育产物进行检测时，lfd出现两条红带为阳性，一条位于质控区，一条位于检测区，阳性结果表明扩增产物中含有待检测核酸片段；lfd的质控区出现一条红带，检测区没有红带，表示为阴性，阴性结果表明扩增产物中不含有检测片段。

20、上述优选的反应条件可进一步提高通用型禽流感病毒的检测效率。

21、本发明还提供了上述核酸分子组合物、试剂、试剂盒在非诊断性检测禽通用型禽流感中的应用。

22、优选地，在禽类养殖环境监测应用方面，通过定期检测环境样本中的禽流感病毒核酸，来确定病毒是否在环境中存在，以此作为养殖场清洁和消毒措施是否有效的指标。如果检测到病毒，养殖场可以及时加强消毒和隔离措施，防止病毒在禽类群体中传播，预防禽流感的爆发。

23、优选地，在禽类交易市场的监测应用方面，从市场不同摊位采集样本进行禽流感病毒检测，一旦发现病毒，就可以对相关区域进行封闭和消毒处理，这种检测主要是为了公共卫生和禽类贸易安全。

24、优选地，在候鸟迁徙路线的生态监测应用方面，在湿地等候鸟聚集区域采集水样、土壤样本和候鸟粪便样本检测禽流感病毒。这是因为候鸟是禽流感病毒的天然宿主之一，它们在迁徙过程中可能会传播病毒。这种监测的目的是了解禽流感病毒在自然生态环境中的分布和传播动态，以便提前做好防控措施，防止病毒传播给家禽或者人类。

25、本发明的具有以下有益效果：

26、本发明根据通用型禽流感病毒的相对保守序列设计特异的crrna和rt-raa引物，当crrna识别到目标序列，激活lwacas13a蛋白对报告探针进行切割，随着采用侧向流动试纸条(lfd)读取检测结果，实现了简便、高效、可视化检测通用型禽流感病毒的目的。本发明提供的检测通用型禽流感病毒的方法在42℃条件下，反应30min，即可实现目的基因的有效扩增，扩增后在37℃的crispr检测系统下孵育20min，孵育后产物再通过lfd判定，试验结果显示本发明提供的核酸分子组合物对通用型禽流感病毒特异性良好，与新城疫病毒(ndv)、鸡传染性支气管炎病毒(ibv)、传染性法氏囊病病毒(ibdv)、鸭坦布苏病毒(dtmuv)无交叉反应；最低检测限可达到10copies/μl；具有良好的重复性与稳定性；临床检测符合率达到96.7％，可用于通用型禽流感的临床快速诊断和疫病净化。