一种H5、H7亚型重组禽流感病毒血凝抑制试验抗原的制备方法与流程

本发明属于兽用生物制品领域，尤其涉及一种h5、h7亚型重组禽流感病毒血凝抑制试验抗原的制备方法。

背景技术：

1、禽流感病毒血凝抑制试验是目前who进行全球流感检测所普遍采用的试验方法，可用于禽流感病毒分离株ha亚型的鉴定，也可用来检测禽血清中是否有与抗原亚型一直的感染或免疫抗体，该实验方法需要在每次试验时进行抗原标准化，以便准确检测待检毒株的毒力，从而真实反映禽流感疫苗的免疫效果。

2、由于不同禽流感病毒(avian influenza virus，aiv)的血凝素(ha)和神经氨酸酶(na)有不同的抗原性，目前在禽中已发现有16种特异的ha和9种特异的na，分别命名为h1～h16，n1～n9，不同的ha和不同的na之间可形成100多种亚型的禽流感病毒。根据禽流感病毒的致病性强弱，aiv可分为高致病性禽流感病毒(high pathogenic avian influenzavirus，hpavi)和低致病性禽流感病毒(low pathogenic avian influenza virus，lpaiv)。目前，在国内流行的h5或h7亚型禽流感病毒均为hpaiv。

3、当前h5、h7亚型禽流感病毒抗原的ha试验中，标准抗原对现有毒株的检测特异性不强，导致不能真实反应血清抗体的水平，因此亟需一种稳定可靠的血凝抑制试验的检测方法。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供了一种h5、h7亚型重组禽流感病毒血凝抑制试验抗原的制备方法。

2、为实现以上技术目的，本发明采用如下技术方案：

3、一种h5、h7亚型重组禽流感病毒血凝抑制试验抗原的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

4、(1)接种毒株，孵化培养，吸取尿囊液备用；

5、(2)浓缩尿囊液至原体积的1/2，并测定病毒效价；

6、(3)调节尿囊液的ph值至6.0～6.4；

7、(4)加入0.1～0.2％的甲醛溶液，置37℃恒温水浴摇床，灭活24h；

8、(5)通过镍离子柱亲和层析纯化；

9、(6)加入冻干保护剂，并低温保存。

10、进一步的，所述h5亚型禽流感病毒为h5n2亚型重组禽流感病毒rhn5801株、h5n2亚型重组禽流感病毒rgd59株。

11、进一步的，所述h7亚型禽流感病毒为h7n9亚型重组禽流感病毒rhn7903株。

12、进一步的，步骤(2)所述病毒效价不低于1:512。

13、进一步的，步骤(5)所述镍离子柱亲和层析纯化方法为：用捣胶棒引流至层析柱，静置；再用5个柱体积(cv)平衡缓冲液平衡介质；用0.45μm滤膜过滤的裂解上清缓慢流经介质；用5cv平衡缓冲液淋洗、洗涤介质；用洗脱缓冲液洗脱目的蛋白并收集。

14、进一步的，步骤(6)所述冻干保护剂的配置方法为：称量蔗糖20～40g，加入到100ml pbs溶液中充分溶解，置100℃高压灭菌30分钟，置2～8℃保存备用。

15、所述的h5、h7亚型重组禽流感病毒血凝抑制试验抗原的制备方法在禽流感疫苗毒株毒力检测中的应用。

16、采用上述技术方案，本发明具有的有益效果为：

17、本发明克服了现有禽流感病毒抗体血凝抑制试验中标准品不能准确检测待检毒株的毒力，不能真实反映禽流感疫苗免疫效果的缺陷，本发明使用的毒株特异性强，使检测结果更加准确可靠，更能评价疫苗的有效性。

18、本发明对现有灭活工艺进行了优化，调整ph值后更容易使杂蛋白析出，降低影响检测结果的成份；通过调节ph值改变血凝素结合能力，使血凝素活力更容易结合血清抗体。

19、本发明采用的纯化工艺可以去除抗原中的杂蛋白、无机盐及尿酸盐，减少检测过程中的误差。

20、本冻干保护剂成分单一，但能达到稳定、长期保存的效果。

技术特征：

1.一种h5、h7亚型重组禽流感病毒血凝抑制试验抗原的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种h5、h7亚型重组禽流感病毒血凝抑制试验抗原的制备方法，其特征在于，所述h5亚型禽流感病毒为h5n2亚型重组禽流感病毒rhn5801株、h5n2亚型重组禽流感病毒rgd59株。

3.根据权利要求1所述的一种h5、h7亚型重组禽流感病毒血凝抑制试验抗原的制备方法，其特征在于，所述h7亚型禽流感病毒为h7n9亚型重组禽流感病毒rhn7903株。

4.根据权利要求1所述的一种h5、h7亚型重组禽流感病毒血凝抑制试验抗原的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述病毒效价不低于1:512。

5.根据权利要求1所述的一种h5、h7亚型重组禽流感病毒血凝抑制试验抗原的制备方法，其特征在于，步骤(5)所述镍离子柱亲和层析纯化方法为：用捣胶棒引流至层析柱，静置；再用5个柱体积(cv)平衡缓冲液平衡介质；用0.45μm滤膜过滤的裂解上清缓慢流经介质；用5cv平衡缓冲液淋洗、洗涤介质；用洗脱缓冲液洗脱目的蛋白并收集。

6.根据权利要求1所述的一种h5、h7亚型重组禽流感病毒血凝抑制试验抗原的制备方法，其特征在于，步骤(6)所述冻干保护剂的配置方法为：称量蔗糖20～40g，加入到100mlpbs溶液中充分溶解，置100℃高压灭菌30分钟，置2～8℃保存备用。

7.如权利要求1所述的h5、h7亚型重组禽流感病毒血凝抑制试验抗原的制备方法在禽流感疫苗毒株毒力检测中的应用。

技术总结本发明提供了一种H5、H7亚型重组禽流感病毒血凝抑制试验抗原的制备方法，该方法克服了现有禽流感病毒抗体血凝抑制试验中标准品不能准确检测待检毒株的毒力，不能真实反映禽流感疫苗免疫效果的缺陷，通过调整灭活和纯化工艺，调整pH值，使杂蛋白更容易析出，降低影响检测结果的成份，改变血凝素结合能力，使血凝素活力更容易结合血清抗体，去除抗原中的杂蛋白、无机盐及尿酸盐，减少检测过程中的误差。本发明提供的方法特异性强，使检测结果更加准确可靠，更能评价疫苗的有效性。技术研发人员：仇微红,叶贺佳,李霞,胡秀美,李君宝,万红,罗开健受保护的技术使用者：广州市华南农大生物药品有限公司技术研发日：技术公布日：2025/1/13