一种骨肉瘤类器官培养基及种胶方法与流程

本发明属于细胞培养，具体涉及一种骨肉瘤类器官培养基及种胶方法。

背景技术：

1、公开该背景技术的信息旨在增加对本发明总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

2、骨肉瘤(osteosarcoma)又称成骨肉瘤，是一种恶性骨肿瘤，特点是肿瘤细胞可直接产生骨样组织。骨肉瘤好发于青少年，好发部位为股骨远端、胫骨近端和肱骨近端的干骺端。常形成梭形的瘤体，可累及骨膜、骨皮质及髓腔，病灶切面呈鱼肉状，棕红或灰红色。然而，目前骨肉瘤的发病机制并不明确。在体外构建的骨肉瘤类器官是研究骨肉瘤的优势模型，便于对其进行研究分析，对发病机制的研究能够起到积极作用。

3、类器官的3d培养体系为细胞提供类似体内生长环境的基质，细胞通过与胞外基质间的联系形成一定的三维结构，与体内细胞生长情况更为相似。但目前，骨肉瘤类器官培养存在成功率低，扩增速度慢，原代培养流程花费时间长等问题，因此，急需一种优良的骨肉瘤类器官培养基和更加快捷的种胶方法。

技术实现思路

1、针对现有技术中的问题，本发明提供一种骨肉瘤类器官培养基，能够增加类器官培养成功概率和提高骨肉瘤类器官扩增效率。

2、本发明还提供了一种骨肉瘤的种胶方法，减少类器官原代培养花费时间。

3、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

4、一种骨肉瘤类器官培养基，在基础培养基中添加以下成份：

5、b27添加剂(不含维生素a) 0.5-2×，n-2添加剂 1×，glutamax添加剂 1-10mm，酪蛋白氨基酸 100-1000mg/l，n-乙酰半胱氨酸 0.5-5mm，烟酰胺 1-100mm，维生素c 0.5-2μm，丙酮酸钠 1-5mm，人胃泌素 1-100nm，wnt3a 5-20ng/ml，r-spondin 1蛋白 100-1000ng/ml，noggin蛋白 10-500ng/ml，activin a（激活素a蛋白） 10-100ng/ml，forskolin 1-15μm，y-27632 5-15μm，sb202190 10-20 nm，chir99021 1-10μm，a83-01 0.1-10μm，h-egf（人表皮生长因子） 5-500ng/ml，fgf-10（成纤维细胞生长因子10） 20-500ng/ml，hgf（肝细胞生长因子） 10-30ng/ml，vegf a（血管内皮生长因子a） 10-100ng/ml，igf 1 (胰岛素样生长因子1) 1-5μg/ml，il-6 1-2μg/ml，青霉素-链霉素双抗 1-2×，血清 1%-10%。

6、优选地，上述骨肉瘤类器官培养基，在基础培养基中添加以下成份：

7、b27添加剂(不含维生素a) 1×，n-2添加剂 1×，glutamax添加剂 8mm，酪蛋白氨基酸 500-1000mg/l，n-乙酰半胱氨酸 0.5-1mm，烟酰胺 5-15mm，维生素c 1-2μm，丙酮酸钠1-5mm，人胃泌素 50-100nm，wnt3a 10-15ng/ml，r-spondin 1蛋白 500-1000ng/ml，noggin蛋白 200-500ng/ml，activin a（激活素a蛋白） 80-100ng/ml，forskolin 8-15μm，y-2763210-15μm，sb202190 10-20nm，chir99021 5-10μm，a83-01 5-10μm，h-egf（人表皮生长因子）5-50ng/ml，fgf-10（成纤维细胞生长因子10） 20-100ng/ml，hgf（肝细胞生长因子） 10-30ng/ml，vegf a（血管内皮生长因子a） 20-50ng/ml，igf 1 (胰岛素样生长因子1) 1-5μg/ml，il-6 1-2μg/ml，青霉素-链霉素双抗 1×，血清 10%。

8、更优选地，上述骨肉瘤类器官培养基，在基础培养基中添加以下成份：

9、b27添加剂(不含维生素a) 1×，n-2添加剂 1×，glutamax添加剂 8mm，酪蛋白氨基酸 600mg/l，n-乙酰半胱氨酸 0.5mm，烟酰胺 10mm，维生素c 1μm，丙酮酸钠 1mm，人胃泌素 100nm，wnt3a 10ng/ml，r-spondin 1蛋白 900ng/ml，noggin蛋白 400ng/ml，activin a（激活素a蛋白） 100ng/ml，forskolin 10μm，y-27632 10μm，sb202190 15nm，chir99021 5μm，a83-01 9μm，h-egf（人表皮生长因子） 5ng/ml，fgf-10（成纤维细胞生长因子10） 20ng/ml，hgf（肝细胞生长因子） 25ng/ml，vegf a（血管内皮生长因子a） 50ng/ml，igf 1 (胰岛素样生长因子1) 5μg/ml，il-6 1.5μg/ml，青霉素-链霉素双抗 1×，血清 10%。

10、所述基础培养基选自advanced dmem/f12、rpmi 1640和leibovitz’s l-15培养基中的任意一种；优选为advanced dmem/f12培养基。

11、所述血清为人血清、胎牛血清或者血清替代物。

12、上述培养基的配制方法可以通过本领域常规的方法将各组份以固体或溶液状态添加于基础培养基混合均匀即可。

13、一种骨肉瘤类器官的原代培养方法，包括以下步骤：

14、（1）将收集的骨肉瘤组织处理成细胞/细胞团沉淀；

15、（2）将骨肉瘤类器官培养基预热至37℃；

16、（3）将细胞/细胞团沉淀和液态基质胶混合均匀获得重悬液；

17、（4）将重悬液在凝固前滴加到预热的骨肉瘤类器官培养基中形成胶球，培养后获得原代骨肉瘤类器官。

18、步骤（3）中，基质胶在重悬液内的浓度为75-95%。

19、步骤（4）中，重悬液和骨肉瘤类器官培养基的体积比为1:（10-50）。胶球的体积为20-40μl/粒。

20、本发明的协同作用如下：

21、骨肉瘤类器官培养基中加入wnt3a、rspondin 1蛋白，noggin蛋白，成纤维细胞生长因子10，可以协同激活增殖干细胞的wnt信号通路，达到促进干细胞生长、增殖、分化和抑制凋亡的效果，促进类器官自我更新；骨肉瘤类器官培养基中加入重组人表皮生长因子egf、胎牛血清、hgf、血管内皮生长因子a、activin a、胰岛素样生长因子1、维生素c极大的促进干细胞的干性维持、细胞活性，使骨肉瘤类器官培养成功率提升了30%。

22、本发明具有以下优点：

23、本发明提供的骨肉瘤类器官培养基能够促进类器官细胞保持较高的增殖能力、维持自我更新。本发明采用的液体滴注种胶方式，减少了类器官常用方法的等待基质胶固定等步骤，极大的缩短类器官培养时间，增加了胶滴与培养基的接触面积，方便类器官与培养基进行物质交换，大大提高了类器官的扩增效率和建模成功率。